sitokinin sintetik, yang dalam penggunaannya dipengaruhi oleh ZPT lainnya. Sitokinin mempengaruhi berbagai proses fisiologi di dalam tanaman. Aktivitas
yang utama dari sitokinin adalah sitokenesis atau pembelahan sel. Aktivitas ini yang menjadi kriteria utama untuk menggolongkan suatu zat pengatur tumbuh ke
dalam sitokinin Wattimena 1988.
2.4 Penelitian Kemaitan yang Telah Dilakukan
Beberapa penelitian terhadap kemaitan yang telah dilakukan diantaranya oleh Adhiyanto 2001 dan Zumrotun 2006, ringkasan hasilnya dapat dilihat
pada Tabel 1.
Tabel 1 Ringkasan hasil penelitian kemaitan yang telah dilakukan
No Nama Judul
Tahun Hasil
1 2
Eko Adhiyanto Zumrotun
Kajian Beberapa Aspek Ekologi Kemaitan Lunasia
amara Blanco di Taman Nasional Meru Betiri, Jawa
Timur Peranan Sanrego Lunasia
amara Blanco dalam Memperpendek Siklus
Ranggah dan Meningkatkan Libido Seksual Rusa Timor
Cervus timorensis de Blainville Jantan
2001
2006 a Kemaitan mempunyai
spesifikasi ekologi yang khas, tersebar secara
mengelompok, memiliki kondisi habitat yang ekstrim.
Kemaitan menempati ruang dengan ciri ekologi solum
yang tipis yang terkadang didominasi dengan bebatuan
dengan kelerengan yang terjal.
b Faktor eksploitasi manusialah yang sangat mengancam
eksistensi kemaitan di habitat aslinya. Diperparah lagi
karena karakteristiknya yang termasuk ke dalam kategori
slow growing species dan kondisi lingkungannya yang
cukup ekstrim.
Penggunaan bubuk kering daun L. amara pada rusa timor jantan
dapat memperpendek periode ossifikasi ranggah dan
berpengaruh nyata terhadap peningkatan libido. Semakin
tinggi dosis L. amara yang diberikan maka semakin cepat
pula masa ossifikasi dan semakin tinggi libido seksualnya.
BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Unit Kultur Jaringan Laboratorium Konservasi Tumbuhan Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas
Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan selama 5 bulan, terhitung dari bulan September 2006 sampai akhir Januari 2007.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1 Bahan Penelitian
a. Bahan Media Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS Murashige
Skoog. Media ditambahkan zat pengatur tumbuh sitokinin BAP Benzylaminopurin dengan beberapa konsentrasi yang berbeda yaitu 0; 0,5; 1; 1,5 dan 2 mgl. Media MS
ini dibuat dalam bentuk padat dengan menambahkan agar-agar pada media.
b. Bahan Tanaman Bahan tanaman yang digunakan sebagai eksplan dalam penelitian ini adalah
pucuk kemaitan Lunasia amara Blanco. dari koleksi tanaman Laboratorium Konservasi Tumbuhan Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata,
Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Ukuran pucuk yang digunakan panjangnya kurang lebih 2 cm. Ukuran pucuk yang dijadikan eksplan mempengaruhi
keberhasilan viabilitas pada kondisi invitro. Pucuk dengan ukuran lebih besar biasanya lebih tahan saat dipindahkan pada kondisi invitro serta pertumbuhan lebih
cepat Wattimena et al. 1992. Tanaman induk sebagai sumber eksplan dalam kondisi tumbuh yang baik, hal
ini dapat dilihat pada saat pemotongan pucuk, induk sedang berbunga tanpa terjadi kerontokan, daun tidak layu dan berwarna hijau tua, serta tinggi rata-rata tanaman
sekitar 2 meter.
c. Bahan Sterilisasi Sterilisasi
dilakukan terhadap bahan eksplan dan media serta alat-alat yang digunakan. Bahan-bahan sterilisasi tersebut diantaranya : bubuk deterjen, fungisida
cair, HgCl
2
, alkohol 70, klorin, cairan antiseptik dan air steril.
3.2.2 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi botol kultur, oven, kompor gas, gelas piala, hot plate dan magnetic stirer, cawan petri, spatula,
autoclave , bunsen, kertas pH, pipet, scalpel, pinset, timbangan analitik, Laminar Air
Flow Cabinet , sprayer, termometer ruangan, timer, rak-rak kultur, dan Air
Conditioner AC.
Dengan masing-masing spesifikasi kegunaan sebagai berikut, 1.
Kegiatan sterilisasi a.
Autoclave untuk mensterilkan alat dan media b.
Oven sebagai tempat penyimpanan peralatan yang telah disterilkan c.
Bunsen digunakan untuk mensterilkan alat yang digunakan saat melakukan penanaman
d. Kompor gas digunakan untuk memanaskan autoclave
2. Kegiatan pembuatan media
a. Timbangan analitik untuk menimbang bahan-bahan penyusun media
b. Pipet 10 ml untuk pengambilan larutan dalam pembuatan media
c. Hot plate and magnetic stirer sebagai tungku pemanas listrik dan
pengaduk magnetik dalam pembuatan media d.
Gelas piala 1000 ml digunakan sebagai wadah dalam pembuatan media e.
Kertas pH untuk mengetahui tingkat kemasaman atau basa dalam pembuatan media
3. Kegiatan penanaman
a. Cawan petri digunakan sebagai tempat memotong eksplan
b. Scalpel untuk memotong eksplan
c. Pinset untuk menanam eksplan
d. Laminar Air Flow Cabinet sebagai ruang kerja dalam penanaman eksplan
e. Botol kultur sebagai tempat menanam eksplan
4. Inkubasi
a. Rak kultur sebagai tempat menyimpan botol kultur
b. Termometer ruangan untuk mengetahui suhu ruangan inkubasi
c. Timer untuk mengatur lamanya pencahayaan
d. Air Conditioner AC untuk menjaga suhu tetap stabil yaitu sekitar 25-
28 °C.
3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Pembuatan Media Kultur
Tahapan pertama dalam pelaksanaan kultur jaringan adalah persiapan media. Dalam media diberikan berbagai garam mineral, air, gula sukrosa, asam amino,
vitamin, zat pengatur tumbuh ZPT, dan agar sebagai pemadat media. Hal ini bermanfaat bagi pertumbuhan dan perkembangan eksplan.
Langkah awal dalam pembuatan media kultur adalah pembuatan larutan induk stock, yang terdiri atas larutan induk unsur makro-mikro, larutan induk
vitamin, larutan induk Fe-EDTA dan myo-inositol Lampiran 1. Pembuatan larutan induk ini bertujuan untuk efisiensi dan kecermatan pekerjaan menimbang bahan
kimia. Adapun tahapan selanjutnya dalam pembuatan media MS padat sebanyak 1
liter adalah sebagai berikut: a.
500 ml air aquades ditambahkan ke dalam gelas piala 1000 ml. b.
Dimasukkan larutan stok sesuai konsentrasi penggunaan, terdiri dari larutan A sebanyak 20 mll, larutan B sebanyak 20 mll, larutan C sebanyak 5 mll,
larutan D sebanyak 5 mll, larutan E sebanyak 5 mll, larutan F sebanyak 5 mll, vitamin sebanyak 5 mll dan Myo-inositol sebanyak 10 mll, pembuatan
larutan stok untuk media MS dapat dilihat pada Lampiran 1. c.
Ditimbang dan dimasukkan 30 gram gula pasir. d.
Dijadikan volume larutan mendekati 1000 ml, dengan batang magnetik di dalamnya. Kemudian ukur pH pada kisaran 5.7-6 dengan penambahan NaOH
bila terlalu asam atau HCl bila terlalu basa. e.
Ditambahkan pemadat yaitu agar-agar sebanyak 7 gram, lalu dipanaskan hingga agar-agar larut dan mendidih sampai warna larutan bening.
f. Ditambahkan larutan zat pengatur tumbuh sesuai dengan kebutuhan
konsentrasi BAP 0; 0,5; 1; 1,5; 2 mgl. Setiap perlakuan dibuat 10 ulangan. g.
Dituangkan media tersebut ke dalam botol kultur sebanyak 20 ml per botol untuk seluruh perlakuan, dan ditutup..
h. Tahapan terakhir, botol kultur yang berisi media dimasukkan ke dalam
autoclave dengan suhu 121
°C 250°F pada tekanan 17,5 pound square inchi psi selama 20 menit.
i. Waktu sterilisasi dihitung setelah tekanan yang diinginkan tercapai. Setelah
pemanasan dengan autoklaf selesai, media dibiarkan menjadi dingin pada suhu kamar, dan disimpan dalam ruang inkubasi dengan suhu 26
°C. Menurut Sandra 2003, media yang telah disterilisasi disimpan di tempat
yang sejuk dan dibiarkan selama 1 minggu. Hal ini bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi di dalam media kultur sebelum digunakan untuk menanam
eksplan. Skema prosedur pembuatan media MS dapat dilihat pada Lampiran 2.
3.3.2 Sterilisasi
a. Sterilisasi Lingkungan Kerja Untuk menjaga kebersihan lingkungan kerja dapat dilakukan dengan cara
menerapkan peraturan tertentu dengan membatasi orang-orang yang masuk ke dalam ruangan dan selalu membersihkannya dua hari sekali dengan cairan desinfektan.
Permukaan tempat kerja harus selalu dibersihkan, baik sebelum, selama maupun setelah digunakan. Pembersihan dapat dilakukan dengan kapas atau tisu yang telah
disemprot dicelupkan ke dalam alkohol 70. Sebelum dan selama pemakaian, blower
atau peniup udara dalam laminar air flow cabinet harus selalu dinyalakan, hal ini dilakukan untuk menghindari kontaminan masuk kedalam botol kultur saat
penanaman. Selain itu pada saat memulai pekerjaan dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70 baik terhadap kedua telapak tangan, kotak tanam maupun alat-alat yang
akan dipakai dalam kotak tanam.
b. Sterilisasi Alat-alat dan Media Kultur Alat-alat yang digunakan dalam penelitian harus selalu dalam keadaan steril.
Gelas cawan petri, botol-botol kosong, tutup botol, alat-alat logam pinset, gagang
scalpel , spatula dibungkus rapi dengan kertas koran. Semuanya itu disterilkan
dengan autoklaf pada suhu 121 °C 250°F pada tekanan 17,5 pound square inchi
psi selama 1 jam. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.
Pada saat melakukan penanaman, alat-alat diseksi seperti pinset, dan mata pisau scalpel disterilkan dengan pembakaran di atas api bunsen, setelah sebelumnya
dicelupkan dalam alkohol 70. Media tanam dan air mineralgalon juga disterilkan dengan autoklaf. Air
galon disterilisasi dengan waktu, suhu, dan tekanan yang sama untuk sterilisasi alat, air galon ini disterilkan guna mendapatkan air steril yang akan digunakan pada saat
sterilisasi eksplan sebelum di tanam, sedangkan media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121
°C 250°F pada tekanan antara 15-17,5 psi selama 20-25 menit.
c. Sterilisasi Eksplan Bagian pucuk kemaitan dipotong sepanjang 2 cm dari tanaman induknya
dengan menggunakan pisau silet yang tajam. Setelah jumlah pucuk terpenuhi, kegiatan sterilisasi dilakukan di laboratorium, sebagai berikut :
1. Pucuk dibersihkan dari segala kotoran yang menempel dan mengalirinya
dengan air ledeng selama 15 menit. Hal ini dilakukan untuk mensiasati agar kandungan tanin alkaloid pada eksplan dapat keluar habis sehingga pada saat
penanaman nanti dapat mereduksi timbulnya peristiwa browning. 2.
Eksplan direndam dalam larutan deterjen encer 3gl selama 7 menit sambil mengocoknya lalu membilasnya dengan air steril 3 kali hingga bersih.
3. Kemudian eksplan direndam dalam larutan fungisida cair 0,5 sambil
mengocoknya selama 5 menit. Lalu membilasnya dengan air steril 3 kali hingga bersih.
4. Tahapan sterilisasi selanjutnya dilakukan dalam laminar atau kotak tanam.
Eksplan direndam dan dibilas kembali dengan air steril selama 1 menit. 5.
Sebelum sterilisasi dengan menggunakan cairan pemutih pakaian dilakukan, bahan eksplan direndam terlebih dahulu ke dalam larutan HgCl
2
0,5mgl selama 6 menit, seluruh bagian tanaman terendam dalam larutan. Setelah
selesai, dibilas dengan air steril.
6. Barulah, sterilisasi lanjutan dilakukan dalam larutan cairan pemutih pakaian
yaitu masing-masing dengan konsentrasi 9 selama 5 menit, kemudian larutan 6 selama 5 menit, lalu larutan 3 selama 5 menit. Setiap kali
sesudah sterilisasi dalam larutan pemutih pakaian, bahan eksplan tersebut dibilas dengan air steril 3 kali. Setelah itu barulah ke tahap selanjutnya yaitu
penanaman eksplan.
3.3.3 Penanaman
Penanaman dilakukan dalam kotak tanam Laminar Air Flow Cabinet. Eksplan pucuk yang sudah melewati tahap sterilisasi, dipindahkan ke dalam cawan
petri yang telah berisi air steril setinggi ±16 tinggi cawan petri dan 3 tetes cairan antiseptik. Berbeda dengan teknik kultur meristem, dalam kultur pucuk, daun
primordia tidak perlu dihilangkan. Kemudian pucuk diiris dengan keseragaman panjang 1cm. Setelah itu
potongan-potongan tersebut ditanam pada botol kultur dengan media kultur yang telah disiapkan sesuai perlakuan. Satu botol kultur digunakan untuk satu eksplan.
3.4 Pengamatan peubah yang diukur
Pengamatan dilakukan terhadap seluruh eksplan yang ditanam pada setiap satuan perlakuan, meliputi
a. Persentase hidup kemaitan dalam kultur jaringan kuantitatif b. Persentase kontaminan cendawan kuantitatif
c. Persentase browning kuantitatif d. Morfologi daun meliputi warna dan bentuk secara visual kualitatif
e. Tinggi tanaman kultur kuantitatif
3.5 Metode Analisis
