f. Ditambahkan larutan zat pengatur tumbuh sesuai dengan kebutuhan
konsentrasi BAP 0; 0,5; 1; 1,5; 2 mgl. Setiap perlakuan dibuat 10 ulangan. g.
Dituangkan media tersebut ke dalam botol kultur sebanyak 20 ml per botol untuk seluruh perlakuan, dan ditutup..
h. Tahapan terakhir, botol kultur yang berisi media dimasukkan ke dalam
autoclave dengan suhu 121
°C 250°F pada tekanan 17,5 pound square inchi psi selama 20 menit.
i. Waktu sterilisasi dihitung setelah tekanan yang diinginkan tercapai. Setelah
pemanasan dengan autoklaf selesai, media dibiarkan menjadi dingin pada suhu kamar, dan disimpan dalam ruang inkubasi dengan suhu 26
°C. Menurut Sandra 2003, media yang telah disterilisasi disimpan di tempat
yang sejuk dan dibiarkan selama 1 minggu. Hal ini bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi di dalam media kultur sebelum digunakan untuk menanam
eksplan. Skema prosedur pembuatan media MS dapat dilihat pada Lampiran 2.
3.3.2 Sterilisasi
a. Sterilisasi Lingkungan Kerja Untuk menjaga kebersihan lingkungan kerja dapat dilakukan dengan cara
menerapkan peraturan tertentu dengan membatasi orang-orang yang masuk ke dalam ruangan dan selalu membersihkannya dua hari sekali dengan cairan desinfektan.
Permukaan tempat kerja harus selalu dibersihkan, baik sebelum, selama maupun setelah digunakan. Pembersihan dapat dilakukan dengan kapas atau tisu yang telah
disemprot dicelupkan ke dalam alkohol 70. Sebelum dan selama pemakaian, blower
atau peniup udara dalam laminar air flow cabinet harus selalu dinyalakan, hal ini dilakukan untuk menghindari kontaminan masuk kedalam botol kultur saat
penanaman. Selain itu pada saat memulai pekerjaan dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70 baik terhadap kedua telapak tangan, kotak tanam maupun alat-alat yang
akan dipakai dalam kotak tanam.
b. Sterilisasi Alat-alat dan Media Kultur Alat-alat yang digunakan dalam penelitian harus selalu dalam keadaan steril.
Gelas cawan petri, botol-botol kosong, tutup botol, alat-alat logam pinset, gagang
scalpel , spatula dibungkus rapi dengan kertas koran. Semuanya itu disterilkan
dengan autoklaf pada suhu 121 °C 250°F pada tekanan 17,5 pound square inchi
psi selama 1 jam. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.
Pada saat melakukan penanaman, alat-alat diseksi seperti pinset, dan mata pisau scalpel disterilkan dengan pembakaran di atas api bunsen, setelah sebelumnya
dicelupkan dalam alkohol 70. Media tanam dan air mineralgalon juga disterilkan dengan autoklaf. Air
galon disterilisasi dengan waktu, suhu, dan tekanan yang sama untuk sterilisasi alat, air galon ini disterilkan guna mendapatkan air steril yang akan digunakan pada saat
sterilisasi eksplan sebelum di tanam, sedangkan media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121
°C 250°F pada tekanan antara 15-17,5 psi selama 20-25 menit.
c. Sterilisasi Eksplan Bagian pucuk kemaitan dipotong sepanjang 2 cm dari tanaman induknya
dengan menggunakan pisau silet yang tajam. Setelah jumlah pucuk terpenuhi, kegiatan sterilisasi dilakukan di laboratorium, sebagai berikut :
1. Pucuk dibersihkan dari segala kotoran yang menempel dan mengalirinya
dengan air ledeng selama 15 menit. Hal ini dilakukan untuk mensiasati agar kandungan tanin alkaloid pada eksplan dapat keluar habis sehingga pada saat
penanaman nanti dapat mereduksi timbulnya peristiwa browning. 2.
Eksplan direndam dalam larutan deterjen encer 3gl selama 7 menit sambil mengocoknya lalu membilasnya dengan air steril 3 kali hingga bersih.
3. Kemudian eksplan direndam dalam larutan fungisida cair 0,5 sambil
mengocoknya selama 5 menit. Lalu membilasnya dengan air steril 3 kali hingga bersih.
4. Tahapan sterilisasi selanjutnya dilakukan dalam laminar atau kotak tanam.
Eksplan direndam dan dibilas kembali dengan air steril selama 1 menit. 5.
Sebelum sterilisasi dengan menggunakan cairan pemutih pakaian dilakukan, bahan eksplan direndam terlebih dahulu ke dalam larutan HgCl
2
0,5mgl selama 6 menit, seluruh bagian tanaman terendam dalam larutan. Setelah
selesai, dibilas dengan air steril.
6. Barulah, sterilisasi lanjutan dilakukan dalam larutan cairan pemutih pakaian
yaitu masing-masing dengan konsentrasi 9 selama 5 menit, kemudian larutan 6 selama 5 menit, lalu larutan 3 selama 5 menit. Setiap kali
sesudah sterilisasi dalam larutan pemutih pakaian, bahan eksplan tersebut dibilas dengan air steril 3 kali. Setelah itu barulah ke tahap selanjutnya yaitu
penanaman eksplan.
3.3.3 Penanaman
