3.8.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis
Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut : 1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai
cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4
μ m. Setiap blok parafin, dipotong sebanyak
2 kali, masing-masing untuk pulasan HE dan pulasan imunohistokimia CEA
2. . Sampel blok paraffin yang sudah dipotong tipis 4 μ
m, selanjutnya ditempelkan pada objek gelas.
3. Untuk pulasan immunohistokimia CEA, digunakan kaca objek yang telah di coating agar jaringan dapat menempel pada kaca objek
selama proses pulasan imunohistokimia. Proses pembuatan coating kaca objek gelas adalah sebaerikut :
1. Kaca objek direndam seluruhnya dalam aseton selama 10 menit 2. Masukkan dalam larutan APES 3-Aminopropyltriethoxysilene, Cat
No.a 3548 sigma 5 ml + Aseton 195 ml selama 10 menit. 3. Kaca objek selanjutnya dicuci dengan akuades
4. Keringkan dalam inkubator dengan suhu 37 °
C selama semalaman 5. Kaca objek siap digunakan.
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing, potongan -
potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkan potongan tersebut dalam air hangat, setelah mengembang pindahkan ke objek
gelas. Selanjutnya, kaca objek yang mengandung potongan jaringan diletakkan diatas alat pemanas hot plate atau dimasukkan dalam air
panas floating bath dengan temperatur 50-60 °
C. Setelah parafin melunak karena panas, potongan jaringan diletakkan dalam kaca objek
Universitas Sumatera Utara
kembali dan dikeringkan dengan cara menyandarkan pada alat pemanasan. Setelah kering, potongan jaringan siap untuk dipulas.
3.8.2. Prosedur Pulasan Imunohistokimia CEA
1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 μ
m yang sudah ditempelkan pada objek gelas yang telah dicoating .
2. Preparat yang siap dipulas dimasukkan dalam inkubator 1 mal 8
° c
3. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan Xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit
4. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam Etanol 98 sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, Alkohol 90,
80 dan 70, masing-masing selama 5 menit 5. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit
6. Masukkan ke dalam H
2
O
2
0,3 dalam metanol dingin selama 15 menit
7. Bilas dengan akuades selama 5 menit 8. Masukkan ke dalam larutan Buffer Sitrat yang telah dipanaskan
sebelumnya dalam microwave selama 5 menit dan kemudian sebanyak 2 kali selama 5 menit
9. Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan 10. Bilas dengan akuades selama 5 menit dan keringkan air di sekitar
potongan jaringan 11. Tandai disekeliling potongan jaringan yang ingin dipulas dengan pap
pen 12. Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit
13. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 14. Teteskan blocking serum pada sediaan yang telah ditandai dengan
pap pen selama 5 menit 15. Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit
Universitas Sumatera Utara
16. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 17. Teteskan antibodi primer CEA DAKO dengan pengenceran 1:50,
inkubasi dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 60 menit
18. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit
19. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 20. Teteskan dengan antibodi sekunder, biotinylated universal, inkubasi
dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 10 menit 21. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5
menit 22. Bersihkan dari sisa cairan pencuci
23. Teteskan dengan streptavidin-peroxidase conjugate, inkubasi dalam tempat tertutup pada suhu ruangan selama 10 menit
24. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit
25. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 26. Teteskan larutan kromogen dab selama 5-10 menit
27. Bilas degan air mengalir 28. Counterstain dengan hematoksilin mayer selama 2 menit
29. Bilas dengan air mengalir 30. Dehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan pada cairan
alkohol 70, 80, 90 dan etanol 98 masing-masing 20 celupan 31. Masukkan dalam cairan xylol selama 3 menit
32. Teteskan entelan dan tutup dengan kaca penutup.
Universitas Sumatera Utara
3.9. Alat dan Bahan Penelitian 3.9.1. Alat-alat Penelitian
Kategori