BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1.Tempat Dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Sentra Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU , Laboratorium Patologi Anatomi RSU.H. Adam Malik
dan praktek swasta di Medan.
3.1.2. Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan selama bulan Oktober 2009 hingga Desmber 2009 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data,
pengumpulan sampel, penelitian dan penulisan.
3.2. Metode Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan observasional dengan pendekatan analitik deskriptif, dimana pada tiap kasus tidak diberi
perlakuan, namun hanya melihat hasil pulasan tampilan imunohistokimia CEA. Pengukuran variabelnya dilakukan hanya satu kali dan pada saat
itu.
3.3. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian
3.3.1. Populasi
Populasi penelitian mencakup sediaan blok parafin yang didiagnosa sebagai kolitis ulserosa,displasia dan adenokarsinoma kolon pada
Universitas Sumatera Utara
Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU dan praktek swasta di Medan
3.3.2. Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari biopsi kolon yang diperoleh sejak Januari 2007 - Nopember 2009 arsip.
3.3.3. Besar Sampel
Besar sampel yang diperkirakan pada penelitian ini dihitung dengan menggunakan rumus :
n = z.d
2
.p 1-p d
2
Keterangan : •
n = jumlah populasi •
z = tingkat kepercayaan 95 Æ
z-score = 1,96. •
p = proporsi seluruh lesi menurut Izhar N Baghwan 1996 50 Æ
0,25. •
d = ketepatan 0,5 Hasil perhitungan : n = 1,96 x 0,5
2
x 0,5 0,5
2
= 42,6 Maka jumlah sampel yang dibutuhkan adalah 43 sampel
3.4. Kriteria Inklusi dan Eksklusi
3.4.1. Kriteria Inklusi
Universitas Sumatera Utara
Jaringan dari kolon yang telah didiagnosa kolitis ulserosa,displasia dan
adeno karsinoma kolorektal
3.4.2. Kriteria Eksklusi
• Penyakit Crohn
• Polip adenoma
• Adenoma vilosum
• Sediaan tidak adekuat
3.5. Kerangka Operasional
Kolonoskopi
Biopsi Operasi
Kriteria eksklusi
Histopatologi
Kolitis ulerosa,displasia dan Adenokarsinoma kolorectal
Pewarnaan Imunohistokimia
CEA
Tampilan Imunoekspresi CEA
Universitas Sumatera Utara
3.6. Defenisi Operasional Variabel
Kolitis ulserosa adalah penyakit autoimun dan penyakit infeksi non
spesifik yang memiliki potensi menjadi keganasan. Insiden kolitis ulserosa meningkat dalam dua dekade terakhir. Kolitis Ulcerosa lebih
banyak berjangkit pada daerah rectum dan sigmoid namun dapat meluas ke mukosa kolon proksimal segmen berikutnya. Berbeda
dengan penyakit Crohn dimana usus yang terjangkit adalah ileum terminalis dan sekum, batas antara mukosa yang kena dengan mukosa
normal jelas, sedang pada pada Kolitis Ulcerosa mukosa yang kena sifatnya difus dan batas sulit ditentukan. Kolitis Ulcerosa dimulai
dengan mikroabsespada kripta dan kemudian beberapa abses bersatu membentuk ulkus melibatkan mukosa dan sub mukosa. Histopatologi
pada pinggir ulkus terdapat infiltrasi sel radang neutrofil, limfosit dan sel plasma dan tidak
dijumpai proses granulomatosa. Dalam perjalanan penyakit, Kolitis Ulserosa dibagi dalam 3 tahap: 1. Kolitis ulserosa dini
aktif; 2. Kolitis ulserosa aktif kronik; dan 3. Kolitis ulseratif tenang
3.7. Variabel bebas dan variabel terikat
Variabel bebas adalah Kolitis ulserosa,displasia dan adenokarsinoma
kolon.
Variabel terikat adalah tampilan imunohistokimia CEA Carcinoembryonic antigen.
3.8. Prosedur Penelitian
Universitas Sumatera Utara
3.8.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis
Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut : 1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai
cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4
μ m. Setiap blok parafin, dipotong sebanyak
2 kali, masing-masing untuk pulasan HE dan pulasan imunohistokimia CEA
2. . Sampel blok paraffin yang sudah dipotong tipis 4 μ
m, selanjutnya ditempelkan pada objek gelas.
3. Untuk pulasan immunohistokimia CEA, digunakan kaca objek yang telah di coating agar jaringan dapat menempel pada kaca objek
selama proses pulasan imunohistokimia. Proses pembuatan coating kaca objek gelas adalah sebaerikut :
1. Kaca objek direndam seluruhnya dalam aseton selama 10 menit 2. Masukkan dalam larutan APES 3-Aminopropyltriethoxysilene, Cat
No.a 3548 sigma 5 ml + Aseton 195 ml selama 10 menit. 3. Kaca objek selanjutnya dicuci dengan akuades
4. Keringkan dalam inkubator dengan suhu 37 °
C selama semalaman 5. Kaca objek siap digunakan.
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing, potongan -
potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkan potongan tersebut dalam air hangat, setelah mengembang pindahkan ke objek
gelas. Selanjutnya, kaca objek yang mengandung potongan jaringan diletakkan diatas alat pemanas hot plate atau dimasukkan dalam air
panas floating bath dengan temperatur 50-60 °
C. Setelah parafin melunak karena panas, potongan jaringan diletakkan dalam kaca objek
Universitas Sumatera Utara
kembali dan dikeringkan dengan cara menyandarkan pada alat pemanasan. Setelah kering, potongan jaringan siap untuk dipulas.
3.8.2. Prosedur Pulasan Imunohistokimia CEA
1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 μ
m yang sudah ditempelkan pada objek gelas yang telah dicoating .
2. Preparat yang siap dipulas dimasukkan dalam inkubator 1 mal 8
° c
3. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan Xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit
4. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam Etanol 98 sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, Alkohol 90,
80 dan 70, masing-masing selama 5 menit 5. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit
6. Masukkan ke dalam H
2
O
2
0,3 dalam metanol dingin selama 15 menit
7. Bilas dengan akuades selama 5 menit 8. Masukkan ke dalam larutan Buffer Sitrat yang telah dipanaskan
sebelumnya dalam microwave selama 5 menit dan kemudian sebanyak 2 kali selama 5 menit
9. Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan 10. Bilas dengan akuades selama 5 menit dan keringkan air di sekitar
potongan jaringan 11. Tandai disekeliling potongan jaringan yang ingin dipulas dengan pap
pen 12. Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit
13. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 14. Teteskan blocking serum pada sediaan yang telah ditandai dengan
pap pen selama 5 menit 15. Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit
Universitas Sumatera Utara
16. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 17. Teteskan antibodi primer CEA DAKO dengan pengenceran 1:50,
inkubasi dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 60 menit
18. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit
19. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 20. Teteskan dengan antibodi sekunder, biotinylated universal, inkubasi
dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 10 menit 21. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5
menit 22. Bersihkan dari sisa cairan pencuci
23. Teteskan dengan streptavidin-peroxidase conjugate, inkubasi dalam tempat tertutup pada suhu ruangan selama 10 menit
24. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit
25. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 26. Teteskan larutan kromogen dab selama 5-10 menit
27. Bilas degan air mengalir 28. Counterstain dengan hematoksilin mayer selama 2 menit
29. Bilas dengan air mengalir 30. Dehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan pada cairan
alkohol 70, 80, 90 dan etanol 98 masing-masing 20 celupan 31. Masukkan dalam cairan xylol selama 3 menit
32. Teteskan entelan dan tutup dengan kaca penutup.
Universitas Sumatera Utara
3.9. Alat dan Bahan Penelitian 3.9.1. Alat-alat Penelitian
Alat-alat yang dibutuhkan untuk penelitian ini adalah : mikrotom, waterbath, hotplate, freezer, inkubator, staining jar, rak objek glass, rak
inkubasi, pensil diamond, pipet mikro, timbangan bahan kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas erlenmeyer, gelas beker, tabungan
sentrifuge 15 ml, microwave, spin master, thermolyte stirrer, gelas objek, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.
3.9.2. Bahan Penelitian
Pulasan imunohistokimia menggunakan metode Labelled Streptavidin Biotin Immunoperoxidase Complex, menggunakan Novostain Universal
Detection Kit NCL-RTU-D Novocastra, Inggris. Antibodi primer yang digunakan adalah Monoclonal Mouse Anti-CEA ,Clone12-
140-10 dengan pengenceran 1 :50 -1:100. Novocastra Universal Detection Kit NCL-RTU-D terdiri dari :
1. 1 botol Blocking serum 2. 1 botol Biotinyllated Universal Secondary Antibody
3. 1 botol Streptavidin-Peroxidase Conjugate
Larutan kromogen dab yang digunakan adalah liquid dab substrate kit ncl-l-dab novocastra, inggris : 3,3’- diaminobenzidine.
Larutan PBS Phosphate Buffered Saline pH 7,2 ; terdiri dari : •
Na
2
HPO
4
1,92 g •
Na
2
H
2
PO
4
H
2
O 1,92 g •
NaCl 5,90 g •
Dalam Akuades 1,0 l
Universitas Sumatera Utara
Larutan Buffer Sitrat Sodium Citrate Buffer pH 6,0 terdiri dari : •
1,92 g citric acid dalam akuades 1 L •
0,5 ml tween 20 counterstain dengan menggunakan hematoksilin mayer.
3.10. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia CEA terhadap sampel sediaan jaringan kolitis ulserosa.
Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia CEA adalah sebagai berikut :
1. Kontrol positif : karsinoma kolon yang telah diketahui positif 2. Kontrol negatif : kolitis ulserosa dengan antibodi primer yang
digantikan dengan serum normal 3. Positif : pada sitoplasma dan membran sel berupa warna coklat.
Imunoekspresi dihitung secara semikuantitatif sebagai berikut : Skor 0 : negatif bila tidak terwarnai
Skor +1 : 10 sel yang terpulas fokal Skor +2 : 10-50 sel yang terpulas fokal
Skor +3 : 50 sel yang terpulas difus Sel-sel tumor dengan skor 0 dan +1 dinilai sebagai tampilan lemah
sedangkan dengan skor +2 - +3 di nilai sebagai tampilan kuat.
3.10. Teknik Analisa Data
Kategori