KCKTHPLC KGSMGCMS Uji Komponen Bioaktif Propolis

dalam metanol lalu divorteks. Dua ratus mg ekstrak propolis yang dilarutkan dalam 4 ml etanol dimasukkan ke dalam larutan DPPH 3mM, 1ml. Campuran tersebut dikocok dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit dan diukur absorbansinya. Absorbansinya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Untuk blanko digunakan 0.045 ml akuades sebagai pengganti sampel, sedangkan untuk kontrol DPPH diganti dengan metanol dan sampel diganti akuades. Penurunan absorbansi pada larutan yang berisi sampel menunjukkan adanya aktifitas scavenging atau aktifitas antioksidan. Sebagai standar digunakan vitamin C Ascorbic Acid dengan konsentrasi 0.025, 0.050, 0.100, 0.200, 0.400 μgml. Hasil akhir dinyatakan dalam konsentrasi μgg AAE Ascorbic Acid Equivalent Activity.

4.5.2.4. Uji Komponen Bioaktif Propolis

Uji komponen aktif Propolis dilakukan dengan 2 cara yaitu dengan KCKTHPLC dan KGSMGCMS.

4.5.2.4.1. KCKTHPLC

Komponen bioaktif dari propolis Indonesia dan Brasil dideteksi dengan cara sebagai berikut: Konsentrasi CAPE dan Artepillin-C didalam sediaan dianalisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor PDA Photo Diode Array, dengan menggunakan CAPE bakustandard dan Artepillin-C bakustandard. Instrumen dan Peralatan Mikropipet, KCKT dengan detektor PDA, sentrifugator, refrigerator, timbangan analitik, ultrasonik dan peralatan gelas. Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Larutan Standar Untuk larutan stok CAPE disiapkan menggunakan acetonitril, sedangkan untuk larutan stok Artepillin-C disiapkan menggunakan metanol. Kemudian disimpan dalam refrigerator. Larutan stok ini diencerkan dengan pelarut yang sesuai untuk nantinya dijadikan sebagai larutan standar. Sistem Kromatografi KCKT yang digunakan adalah Waters 2695 yang dilengkapi dengan autosampler dan detektor PDA dengan kondisi sebagai berikut: Kolom : C18 Shimpack 250 mm x 4.6 mm, 5μm, fase gerak : eluen A 0,1 asam format dalam aquabidest, eluen B 0,08 asam format dalam asetonitril eluen A-eluen B = 40 : 60, laju alir : 1,0 mlmenit, volume injeksi : 50 μL, suhu kolom : 40°C, detektor : PDA, 330 nm, metode preparasi sampel dapat dilihat pada Gambar 7.

4.5.2.4.2. KGSMGCMS

Analisis kromatografi gas ditampilkan berdasarkan temperatur yang ditemtukan, yaitu suhu pada kolom dipertahankan pada 60°C selama 2 menit lalu naik sanpai 170°C dengan kecepatan 3°Cmenit. Lalu akhirnya, suhu akan naik sampai 250°C dengan kecepatan 3°Cmenit dan suhu akan stabil pada 250°C selama 120 menit, untuk masing masing sampel. Penyuntikkan dilakukan pada suhu 220°C. Gas pembawa helium dengan kecepatan 10 mlmenit. Puncak yang terbentuk akan direkam untuk menghasilkan kromatogram. 4.5.2.5. Uji Sitotoksik terhadap Cell Line Kanker Payudara MCF7 Menggunakan Metode MTT Mahardika 2004 Sel MCF-7 Sel MCF-7 merupakan salah satu model sel kanker payudara yang banyak digunakan dalam penelitian. Sel tersebut diambil dari jaringan payudara seorang wanita Kaukasian berumur 69 tahun golongan darah O, dengan Rh positif, berupa sel adherent melekat yang dapat ditumbuhkan dalam media pe- Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Divorteks 120 detik Gambar 7. Metode preparasi sampel pada KC-KT numbuh DMEM atau RPMI yang mengandung foetal bovine serum FBS 10 dan antibiotik Penicilin-Streptomycin 1. Sel MCF-7 memiliki karakteristik antara lain resisten agen kemoterapi, mengekspresikan reseptor estrogen ER +, overekspresi Bcl-2 dan tidak mengekspresikan caspase-3 Sel MCF-7 tergolong cell line adherent yang mengekspresikan reseptor estrogen alfa ER-α, resisten terhadap doxorubicin dan tidak mengekspresikan caspase-3 PM-33-[2-dimethyl-8-3-methyl-2-butenylbenzopyran]-6-propenoic acid yang diisolasi dari Propolis Brasil secara nyata menghalangi pertumbuhan dari sel kanker payudara manusia MCF-7 Luo et al. 2001 400 mg sampel propolis + 20 ml metanol Disonifikasi pada suhu 60°C selama 1 jam Di-shaker selama 1 jam pada suhu kamar Disentrifus selama 10 menit kecepatan 10000 rpm, lalu disaring Sebanyak 50 μl diinjeksikan kedalam alat kromatograf Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Alat: Mikropipet 20, 200, 1000 μl, rabung reaksi kecil, rak tabung kecil, vorteks, Conical tube Bahan: Stok sampel 10 mg dalam eppendorf, DMSO, MK, PBS, 96-well plate, tisu makan kotak, buangan untuk media bekas dan PBS Langkah-Langkah Pengerjaan Ambil sel dari inkubator CO 2 , amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80 konfluen untuk dipanen. Panen sel sesuai dengan protokol panen kemudian hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti protokol penghitungan sel. Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 μl. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi kembali sel agar tetap homogen lalu sisakan 3 sumuran kosong jangan diisi sel. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan Foto. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam agar sel pulih kembali setelah panen setelah itu. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan. Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel untuk perlakuan termasuk kontrol sel dan kontrol DMSO sesuai dengan protokol preparasi sampel protokol 9. Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator. Lalu buang media sel balikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan. Masukkan 100 μl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti no. 10. Tiriskan sisa cairan dengan tisu kemudian masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran triplo. Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam waktu inkubasi total: 24-48 jam. Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan foto dahulu.lalu buang media sel, cuci PBS 1x seperti pada no. 11, dan tambahkan reagen MTT 100 μl ke setiap sumuran, termasuk kontrol media tanpa sel. Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator sampai terbentuk formazan. Periksa kembali kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10 dalam 0.1 N HCl. Pekerjaan tidak perlu dilakukan di dalam LAF hood. Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap suhu ruangan semalam. Lalu hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam ELISA reader posisi jangan terbalik. Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ=550-600 nm 595 nm, tekan tombol START. Matikan kembali ELISA reader. Simpan dan tempel kertas hasil ELISA pada LOG BOOK. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, catat di buku catatan pemakaian ELISA READER. Yang terakhir buat grafik absorbansi setelah dikurangi kontrol media vs konsentrasi untuk melihat profil sel hidup. Hitung persentase sel hidup dan analisis harga IC50 dengan Excell Regresi linear dari log konsentrasi atau SPSS ProbitLogit. Keterangan: 1. Kontrol negatif = sel + media. Kontrol DMSO = sel + terbesar DMSO yang digunakan dalam MK. Persen DMSO terbesar dilihat dari konsentrasi DMSO dalam seri konsentrasi sampel yang paling pekat. 2. Stok MTT 5mgml.Timbang 50 mg sebuk MTT, larutkan dalam 10 ml PBS dengan bantuan vortex. Reagen MTT untuk perlakuan 0.5 mgml ฀ ambil 1 ml stok MTT dalam PBS 5mgml, encerkan dengan MK ad 10 ml untuk 1 buah 96 well plate. Gunakan sarung tangan MTT – karsinogenik. Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com 3. Prosentase sel hidup = Absorbansi perlakuan – Absorbansi kontrol media x 100 Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi kontrol media 4.5.3. Tahap 3. Uji II : Uji Eksperimental dengan Hewan Coba untuk Mengetahui Toksisitas Keamanan dari Propolis Indonesia Weil 1952 Penentuan LD50 dilakukan di laboratorium farmakologi MIPA UI Depok dengan menggunakan 20 mencit jantan dan 20 mencit betina turunan DDY yang dibagi menjadi 8 grup masing masing 5 ekor. Mencit diberikan propolis yang dilarutkan dalam propilen glikol dengan 4 macam dosis. Sediaan asli :1.0579 gramml diencerkan dengan larutan CMC dalam air sama banyak, ini disebut sebagai larutan dosis IV : 502.89 mgml, larutan dosis IV dilarutkan dalam larutan CMC 1:3 disebut larutan dosis III : 176.31 mgml, larutan dosis III diencerkan lagi dengan larutan CMC 1:3 disebut sebagai larutan dosis II : 58.77 mgml, larutan dosis II dilarutkan dalam CMC 1:3 disebut sebagai larutan dosis I : 19.59 mgml. ρ = 1.0579 gramml Sediaan asli : 1.0579 gramml 1:1 Dosis IV : 502.89 mgml 1:3 Dosis III : 176.31 mgml 1:3 Dosis II : 58.77 mgml 1:3 Dosis I : 19.59 mgml Masing masing grup mencit diberikan larutan dosis I, II, III, dan IV jadi grup I jantan dan betina diberikan dosis I, grup II jantan dan betina diberikan dosis II, grup III jantan dan betina diberikan dosis III dan grup IV jantan dan Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com betina diberikan diberikan dosis IV, kemudian mencit diamati selama 24 jam, pengamatan meliputi :. a. Gejala gejala toksik. b. Jumlah hewan yang mati pada masing –masing kelompok uji. LD50 dihitung dengan cara sebagai berikut : Log LD50 = log D +d f+1 D = dosis terkecil d = log kelipatan dosis r = lihat tabel, untuk n = 4, k = 3 Kisaran LD50 dihitung dengan cara : log LD50 + 2d.df. Bila dari hasil percobaan komposisi hewan yang mati pada tiap kelompok tidak ada yang sama dengan yang ada ditabel, maka percobaan diulang dengan mengubah dosis sehingga didapat komposisi kematian yang sama. Penentuan potensi ketoksisan akut berdasarkan LD50 adalah sebagai berikut: 1 mg = sangat tinggi 1 – 50 mgkg = tinggi 50 – 500 mgkg = sedang 500 – 5000 mgkg = sedikit toksis 5 – 15 gkg = hampir tidak toksis 15 gkg = relatif tidak berbahaya. 4.5.4.Tahap 4. Uji III : Uji Klinis Uji Klinis dilakukan terhadap pasien kanker payudara yang datang berobat ke Rumah Sakit Kanker Dharmais. Waktu dan Tempat Uji Klinis dilakukan di RS. Kanker Dharmais pada bulan Oktober 2010 sampai Maret 2011. Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Jumlah subyek yang digunakan Uji klinis PI dilakukan pada 30 orang pasien, secara acak, dengan kontrol plasebo. Uji klinis ini merupakan uji klinik fase II yaitu dilakukan pada orang sakit dengan jumlah terbatas. Subyek penelitian adalah kanker payudara yang datang berobat ke RS. Kanker Dharmais RSKD. Selama penelitian berlangsung terjadi pengurangan sampel drop out sebanyak 10 orang. Empat diantaranya tidak datang pada saat pengambilan darah ke 2 sesudah perlakuan dengan alasan sakit 2 orang dan pulang kampung 2 orang. Sebanyak 6 orang tidak taat mengkonsumsi kapsul propolisplasebo sehingga mengakibatkan data tidak lengkap. Pada akhir penelitian tersisa 20 orang yang terbagi menjadi 10 kelompok propolis dan 10 kelompok plasebo. Jumlah peserta yang drop out adalah 33.3, hal ini sudah diantisipasi oleh peneliti dengan menambahkan 50 dari jumlah sampel yang seharusnya. Alur Uji Klinis dan penempatan unit percobaan dapat dilihat pada Gambar 8 dan variabel dan metode pengamatan pada uji klinis pada Tabel 4. Jenis dan Cara Pengumpulan Data Sebelum pengumpulan data dilakukan, calon subjek penelitian diberi penjelasan umum tentang rencana penelitian yang akan dilakukan. Setelah diberi penjelasan, subjek diminta untuk mengisi informed consent formulir kesediaan mengikuti penelitian dengan sukarela kemudian dilakukan screening untuk menyaring subjek yang memenuhi kriteria inklusi. Subjek penelitian yang memenuhi kriteria dan bersedia mengikuti kegiatan ini, secara berturut turut diperiksa kesehatan, pengukuran antropometri, pengambilan darah, pengisian kuesioner dengan wawancara untuk pengumpulan data baseline. Setelah pengambilan darah, subyek diminta untuk minum propolis didepan petugas untuk pertama kali, selebihnya minum dirumah dan dievaluasi petugas setiap 7 hari. Setelah 21 hari mengkonsumsi propolis, keesokan harinya pukul 07.00 dalam keadaan puasa sejak pukul 22.00 WIB subyek diambil darah kedua. Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Pasien kanker payudara 15 subjek Kelompok kontrol 0 mg propolishari Pengukuran kadar.Vit A,C,E,Zn, SOD dan CD8+ dalam darah Pagi 300mg mgmg Pengukuran kadar Vit A,C,E,Zn, SOD dan CD8+ dalam darah End line Setelah 21 hari perlakuan 15 subjek Kelompok dosis 900 mg propolishari Base line 0 hari Penentuan sampel 30 subjek Pengacakan subjek ke unit percobaan dibagi 2 kelompok Subjek yg memenuhi syarat Kriteria inklusi Siang 300mg Malam 300 mg Pagi 0 mg Siang 0 mg Malam 0 mg Kriteria eksklusi Gambar 8. Alur uji klinis dan penempatan Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Tabel 4. Variabel dan metode pengamatan pada uji klinis No Variabel Metoda 1. Karakteristik sampel Pengisian kuesioner 2. Riwayat dan status kesehatan Pengisian kuesioner 3. Antropometri Pengukuran berat dan tinggi badan 4. Respon imunitas Analisis imunitas seluler CD8+ dgn metoda Flow Cytometri menggunakan alat FAScan Becton Dickinson Simultest IMK Lymphocyte. 5. Kadar SOD Metoda Spektrofotometri 6. Kadar serum vitamin A Metoda KCKTHPLC 7. Kadar serum vitamin E Metoda KCKTHPLC 8. Kadar serum Zn Metoda AAS 9. Kadar serum vitamin C Metoda KCKTHPLC 10. Konsumsi propolis Pencatatan oleh petugas KCKT : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Identitas subjek yang dikumpulkan meliputi usia saat mengikuti penelitian, pendidikan terakhir, status kawin, berat badan, tinggi badan, jumlah kelahiran, penggunaan KB atau tidak, berolahraga atau tidak, stadium kanker payudara dan kadar glukosa darah. Data antropometri meliputi berat badan dan tinggi badan. Sebelum pengukuran antropometri, subjek diminta untuk mengenakan baju seminimal mungkin, tidak mengenakan alas kaki, digunakan alat SECA dengan ketelitian 0.1 kg; dan alat ukur tinggi badan dengan mikrotoise dengan ketelitian 0.1 cm. Data antropometri dikumpulkan dua kali yaitu pada saat sebelum dan sesudah 21 Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com hari pemberian propolis. Tabel 5 menyajikan variabel, alat ukur, cara ukur dan hasil ukur. Pemeriksaan kesehatan dilakukan oleh seorang dokter yang meliputi pemeriksaan fisik, anemnesa, keluhan dan riwayat penyakit. Pemeriksaan kesehatan dilakukan 2 kali yaitu pada saat sebelum dan sesudah 21 hari pemberian propolis Pengambilan sampel darah dilakukan 2 kali yaitu pada saat sebelum dan 21 hari sesudah pemberian propolis. Sampel darah diambil sebanyak 10 ml pada setiap pengambilan sampel darah. Sampel darah dibagi dalam 3 tabung berbeda, yaitu tabung pertama berisi 3 ml darah ditambah EDTA untuk analisis imunitas seluler yang segera diperiksa di laboratorium RSK Dharmais. Tabung kedua berisi 3 ml darah ditambah antikoagulan heparin, kemudian dipisahkan plasma yang dihasilkan. Sedimennya dicuci untuk mendapatkan sel darah merah untuk analisis SOD. Analisis SOD dilakukan di Laboratorium Biokimia FKUI Jakarta. Tabung ketiga berisi 4 ml darah tanpa antikoagulan untuk mendapatkan serum. Serum yang diperoleh untuk analisis Zn, vtamin A, vitamin C dan vitamin E. Serum disimpan dalam freezer -90°C sebelum dilakukan analisis. Analisis Zn, vitamin A, vitamin C, dan vitamin E dilakukan di Laboratorium SEAMEO FKUI Jakarta. Pengendalian Kualitas Data Pengendalian kualitas data dilakukan sebagai berikut: 1. Pemberian kapsul Propolis 3 x 1 selama 21 hari dievaluasi dengan cara ditelepon 1 minggu sekali oleh evaluator. 2. Pengambilan data antropometri dilakukan oleh tenaga terlatih. 3. Alat ukur timbangan, tinggi badan dan alat analisis darah digunakan setelah dikalibrasi. 4. Pengambilan darah dilakukan oleh tenaga ahli kesehatan dari Rumah Sakit Kanker Dharmais. Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com 5. Analisis sampel darah dilakukan oleh tenaga ahli di laboratorium RS Kanker Dharmais, SEAMEO Universitas Indonesia Jakarta dan Laboratorium Biokimia dan Molekuler Universitas Indonesia Jakarta. Pengolahan dan Analisis Data Klinis Data hasil uji klinis antara kontrol dan perlakuan diuji beda dengan menggunakan uji beda T saling bebas independent sample T test. Selain itu pada setiap kelompok juga dilakukan perlakuan pre dan post sehingga untuk menentukan apakah perlakuan pre dan post berbeda, maka untuk setiap kelompok control dan perlakuan dilakukan pula uji beda. Uji beda yang dilakukan untuk menentukan apakah ada perbedaan antara pre dan post adalah uji beda T berpasanganpaired sample T test. Seluruh data tersebut di-entry dengan menggunakan software Microsoft Excell 2003 for Windows sedangkan untuk analisis statistik, pengolahan data menggunakan software SPSS 13 for Windows. Etika Penelitian Semua subjek diberikan penjelasan mengenai tujuan penelitian dan kerahasiaan data yang akan diberikan. Subjek yang memenuhi kriteria inklusi akan dijadikan subjek penelitian dan diberikan informed consent yang harus ditandatangani. Penelitian, ini telah lolos uji dari komisi etik penelitian Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia dengan nomor : 411PT02.FKETIK2009. Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Definisi Operasional Usia: umur yang dihitung sejak lahir sampai sampai ulang tahun terkahir. Pendidikan: tingkat pendidikan formal yang diselesaikan responden. IMT: rasio antara berat badan dengan tinggi badan dalam meter kuadrat. Keluarga BerencanaKB: program keluarga berencana yang diikuti responden. Olahraga: aktifitas fisik yang dilakukan oleh responden. Stadium Kanker: tahapan penyakit kanker yang diderita responden. Kadar CD8+: kadar CD8+ dalam darah yang diukur dengan Fluocytometer. Kadar SOD: status antioksidan enzimatis yang dianalisis menggunakan alat Spektrophotometer. Status Vitamin A: kandungan vitamin A dalam serum yang diukur dengan KCKTHPLC. Status Vitamin E: kandungan vitamin E dalam serum yang diukur dengan KCKTHPLC. Status Vitamin C: kandungan vitamin C dalam serum yang diukur dengan spektrophotometer. Kadar Zn Serum: kandungan Zn dalam serum yang dianalisis menggunakan alat AAS. KGSM : Kromatografi Gas - Spektrometri Massa. GCMS : Gas Chromatogram Mass Spectrometry. KCKT : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. HPLC adalah High PerformanceLayer Chromatography. Kapsul propolis: kapsul perlakuan yang mengandung 300 mg propolis per kapsul. Kapsul plasebo: kapsul yang secara fisik samadengan kapsul perlakuan tapi tidak mengandung propolis,hanya mengandung malto dextrin. Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Tabel 5. Variabel, alat ukur, cara ukur, hasil ukur, dan rujukan data Variabel Alat Ukur Cara Ukur Hasil Ukur Rujukan Usia Kuesioner Wawancara 0-39 th 40-49 th ≥ 50 th - Pendidikan Kuesioner Wawancara Tamat SD Tamat SMP Tamat SMA Tamat PTAkademi - Indeks Massa Tubuh IMT Timbangan BB SECA dan pengukur TB microtoise Menimbang dan mengukur BB serta TB responden 18,5gizi kurang 18.5-24.9 gizi baik 25 0-27.0 gizi lebih 27.0 Obesitas Depkes 1996 Program KB Kuesioner Wawancara Ya Tidak Olahraga Kuesioner Wawancara Ya Tidak - Stadium Kanker Kuesioner Wawancara 1A-4B - Kadar CD8+ Laboratorium Darah Vena di analisis di lab Normal: 190-1140 selul RSKD 2010 Kadar SOD Laboratorium Darah Vena di analisis di lab Normal: 1102-1601 unitgramHB Randox German 2008 Status Vitamin A Laboratorium Darah Vena di analisis di lab Normal: ≥ 20 ugdl ≥ 0.7 µmoll Gibson 2005 Status Vitamin E Laboratorium Darah Vena di analisis di lab Def: 11.6 µmoll Gibson 2005 Status Vitamin C Laboratorium Darah Vena di analisis di lab Def: 11.4 µmoll Gibson 2005 Kadar Zn Serum Laboratorium Darah Vena di analisis di lab Normal : ≥ 10.7 µmol ≥70 ugdl Gibson 2005 Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com 5. HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1. Uji Kualitatif dan Kuantitatif Komponen Bioaktif Propolis