Kultur Sel Kanker Kolon 1 Statistik dan Epidemiologi

3. 3.1.Tahap I: Pembuatan RS3 dan Pemanfaatannya sebagai Substrat Fermentasi 3. 3. 1. 1. Produksi RS3 Pati beras diekstrak dengan larutan alkali Wang Wang 2004. Tata cara ekstraksi adalah sebagai berikut: tepung beras ditambah dengan larutan NaOH 0,1, 1 L, diaduk terus-menerus selama 1 jam kemudian disaring dengan 2 lapis kain saring. Filtrat dikumpulkan, disentrifugasi 1500 g,4 o C selama 7 menit. Supernatan dibuang, endapan bagian atas protein dipisahkan dari endapan bagian bawah pati. Fraksi pati ditambah NaOH 0,1 1 L kemudian diperlakukan dengan cara yang sama. Fraksi pati disuspensikan dengan akuades 250 mL kemudian dinetralkan dengan HCl 1 M dan disentrifugasi. Endapan dibilas satu kali lagi dengan cara yang sama kemudian endapan pati dikeringkan di dalam oven 40 o Pati beras atau sagu diproses menjadi RS3 mengikuti cara yang diuraikan oleh Kim et al. 2003dengan sedikit modifikasi. Secara ringkas prosedurnya adalah sebagai berikut: pati 50 g disuspensikan dalam 200 mL akuades, dipanaskan 100 C selama kurang lebih 18 jam. Pati digiling halus kemudian disimpan hingga digunakan. Sedangkan pati sagu hanya dicuci ulang tiga kali dan dikeringkan kemudian disimpan hingga digunakan. o C, 10 menit, diautoklaf 121 o C, 15 Psi, 1jam dan disimpan pada suhu 4 o C selama 12-14 jam untuk menginduksi retrogradasi. Pati retrogradasi disuspensikan dalam 1 L akuades dan dihidrolisis dengan enzim. Perlakuan berikut diterapkan pada pati sagu maupun pati beras: a 10 6 unitamilaseg substrat, 1 jam, 85 o C, b 4500 unit pululanaseg substrat , 3 jam, 55 o C, c 10 6 amilaseg substrat, 1 jam, 85 o C dilan- jutkan dengan 4500 unit pululanaseg substrat, 3 jam, 55 o C. Hidrolisat dipisahkan dengan bantuan sentrifugasi 1500 g, endapan dikumpulkan dan disimpan pada suhu 10 o C selama 16-18 jam. Endapan disuspensikan dalam akuades dan dihomogenkan kemudian dikeringkan dengan pengering semprot yang memiliki suhu inlet 160 o C. 3. 3. 1. 2. Analisis Proksimat dan Kadar Amilosa Kadar air, abu, protein dan mineral di dalam pati sagu dan beras dianalisis dengan metode standar AOAC 2006, sedangkan kadar amilosa pati dianalisis menggunakan metoda kolorimeteri Juliano 1971.

3.3.1.3. Analisis Kadar RS

Kadar RS3 dianalisis menurut metoda Goni et al. 1996. Contoh 50 mg didispersikan di dalam 5 ml larutan KCl-HCl pH 1,5 dan diinkubasi dengan 4400 unit larutan pepsin pada suhu 40 o Bufer tris maleat 0,1 MpH 6.9 4.5 mL ditambahkan ke dalam campuran con- toh dan diinkubasi dengan amilase 100 unit selama 16 jam pada suhu 37 C selama 1 jam untuk menghilangkan protein. o C untuk menghidrolisis pati tercerna. Contoh kemudian disentrifugasi 1000 g, 15 menit sebanyak dua kali. Supernatan dibuang sedangkan endapan dibasahi dengan 1,5 mLakuades dan dilarutkan dengan 1,5 mL KOH 4M. Larutan RS dicampur dengan 2 M HCl dan bufer sodium asetat 0,4M pH 4,75, kemudian diinkubasi dengan 100 unitlarutan amiloglukosidase pada 55 o C selama 45 menit. Contoh disentrifugasi 1000 g selama 15 menit dan supernatannya dikumpulkan. Glukosa dalam supernatan diukur dengan metoda phenol-asam sulfat Dubois et al. 1956. RS dihitung sebagai glukosa x 0,9 dan dinyatakan dalam persen terhadap berat contoh awal.

3.3.1.4. Fermentasi in vitro

Bakteri keadaan liofilisasi diaktifkan. SelanjutnyaC. butyricumBCC B2571 dipelihara dalam mediaReinforced Clostridia Media RCM, dan E. rectaleDSM 17629 dalam mediaPeptone Yeast-extract Glucose PYG Lampiran 2. Kultur disegarkan secara berkala. Botol serum diisi 20 ml media RCM atau PYG dengan sumber karbon berupa 1 RS3 dan 0,5 glukosa. Botol ditutup dengan septum karet kemudian disterilkan 121 o C, 15 menit. Media diinokulasi dengan kultur stok 10 9 kolonimL dan berada pada fase log dibawah aliran gas CO 2 , diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Fermentasi in vitro dengan sumber karbon glukosa 1,5 juga dikerjakan.Pada