3. METODOLOGIPENELITIAN 3.
1. Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakandiLaboratorium
Balai BesarPenelitian dan
Pengembangan Pascapanen di Cimanggu Bogor, Laboratorium Balai Besar Penelitian Tanaman Padi di Sukamandi Subang Jawa Barat dan Laboratorium Mikrobiologi dan
Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata IPB Lodaya Bogor. Penelitian dimulai pada bulan Januari 2009hingga Desember 2010.
3.2. Bahan
Beras varietas Cisokan diperoleh dari Balai Besar Penelitian Tanaman Padi Suka mandi. Pati sagu dari batang sagu: aci kirai dibeli dari unit pengolah sagu
rakyat di Sukabumi Jawa Barat. Enzim amilase dan pululanase diperoleh dari distributor NOVO PT Halim Sakti Pratama, Jakarta. Spesifikasi keduanya
dicantumkan dalam Lampiran 1. Strain bakteri C. butyricum BCC B2571 diperoleh dari Balai Besar Veteriner
di Bogor sedangkan strain bakteri E. rectaleDSM 17629 dibeli dari Koleksi Kultur DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH di
Jerman. Sel epitel non kanker VERO diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP IPB. Sel ini digunakan pada uji toksisitas sebagai kontrol mewakili
sel non kanker. Sel VERO ATCC CCL-81 merupakan sel epitel non kanker. Sel ini berasal dari organ ginjal monyet hijau asal Afrika. Sel lestari asal kanker kolon
manusia HCT-116 ATCC CCL-247
TM
merupakan donasi dari Stem Cell and Cancer Institute SCI Jakarta.
3.3. Metode Penelitian
Penelitian diawali dengan mendapatkan pati beramilosa tinggi dari sagu dan beras. Pati diproses melalui kombinasi retrogradasi dan hidrolisis enzimatis untuk
mendapatkan RS3. RS3selanjutnya disuplementasikan di dalam medium pertum- buhan untuk fermentasi in vitro. Keluaran output dari kegiatan tersebut berupa
profil SCFA dan berdasarkan profil tersebut dipilih RS3 yang potensial sebagai
subtrat fermentasi lebih lanjut. Indikatornya adalah konsentrasi butirat 40 mM dengan rasio molar asetat : propionat : butirat sekitar 2 : 1 : 1. Fermentasi in vitro
dengan substrat potensial dilaksanakan untuk mendapatkan produk fermentasi supernatan yang kemudian dipaparkan pada sel HCT-116. Keluaran dari kegiatan
berupa sel HCT-116 yang dihambat proliferasinya. Garis besar tahap penelitian dicantumkan dalam Gambar 6.
Gambar 6 Diagram alir penelitian Beras Cisokan Sagu: amilosa tinggi
Retrogradasi; Hidrolisis : amilase, pululanase,
kombinasinya RS3
Fermentasi in vitro: C.butyricum BCC B2571,
E.rectale DSM 17629
Output I: Profil SCFA
Aplikasi supernatan mengandung SCFA pada HCT-116
Output II: Proliferasi HCT-116 terhambat dan apoptosis
Ekstraksi Pati beramilosa tinggi
Analisis: Hambatan proliferasi, apoptosis ekspresi gen Bax dan Bcl-
2 Caspase-3 Tahap I
Tahap II
3. 3.1.Tahap I: Pembuatan RS3 dan Pemanfaatannya sebagai Substrat Fermentasi
3. 3.
1. 1.
Produksi RS3
Pati beras diekstrak dengan larutan alkali Wang Wang 2004. Tata cara ekstraksi adalah sebagai berikut: tepung beras ditambah dengan larutan NaOH 0,1,
1 L, diaduk terus-menerus selama 1 jam kemudian disaring dengan 2 lapis kain saring. Filtrat dikumpulkan, disentrifugasi 1500 g,4
o
C selama 7 menit. Supernatan dibuang, endapan bagian atas protein dipisahkan dari endapan bagian bawah pati.
Fraksi pati ditambah NaOH 0,1 1 L kemudian diperlakukan dengan cara yang sama. Fraksi pati disuspensikan dengan akuades 250 mL kemudian dinetralkan
dengan HCl 1 M dan disentrifugasi. Endapan dibilas satu kali lagi dengan cara yang sama kemudian endapan pati dikeringkan di dalam oven 40
o
Pati beras atau sagu diproses menjadi RS3 mengikuti cara yang diuraikan oleh Kim et al. 2003dengan sedikit modifikasi. Secara ringkas prosedurnya adalah
sebagai berikut: pati 50 g disuspensikan dalam 200 mL akuades, dipanaskan 100
C selama kurang lebih 18 jam. Pati digiling halus kemudian disimpan hingga digunakan. Sedangkan pati sagu
hanya dicuci ulang tiga kali dan dikeringkan kemudian disimpan hingga digunakan.
o
C, 10 menit, diautoklaf 121
o
C, 15 Psi, 1jam dan disimpan pada suhu 4
o
C selama 12-14 jam untuk menginduksi retrogradasi. Pati retrogradasi disuspensikan
dalam 1 L akuades dan dihidrolisis dengan enzim. Perlakuan berikut diterapkan pada pati sagu maupun pati beras: a 10
6
unitamilaseg substrat, 1 jam, 85
o
C, b 4500 unit pululanaseg substrat , 3 jam, 55
o
C, c 10
6
amilaseg substrat, 1 jam, 85
o
C dilan- jutkan dengan 4500 unit pululanaseg substrat, 3 jam, 55
o
C. Hidrolisat dipisahkan dengan bantuan sentrifugasi 1500 g, endapan dikumpulkan dan disimpan pada suhu
10
o
C selama 16-18 jam. Endapan disuspensikan dalam akuades dan dihomogenkan kemudian dikeringkan dengan pengering semprot yang memiliki suhu inlet 160
o
C.
3. 3. 1. 2. Analisis Proksimat dan Kadar Amilosa
Kategori