3.3.2.1. Kultur sel
Sel VERO atau sel HCT-116 dipelihara di dalam mediaDulbescco’s Modified Eagle’s Media DMEM yang dilengkapi dengan 10 fetal bovine serumFBS
,
100UmLpenisilin dan 100ugmLstreptomisin. Sel diinkubasi pada 37
o
C, 5 CO
2
Untuk keperluan uji toksisitas, sel VERO atau sel HCT-116 sekitar 3 x 10 .Kompoisi DMEM dicantumkan dalam Lampiran 3.
4
Pada penelitian selanjutnya, sel HCT-116 1-2 x 10 sel
ditumbuhkan di dalam 24 well plate. Setelah sel mencapai sekitar 50 konfluen, medium dibuang dan diganti oleh medium serupa dengan atau tanpa perlakuan
supernatan. Untuk perlakuan, supernatan diencerkan dengan DMEM hingga dihasilkan beberapa konsentrasi asetat, propionat dan butirat. Konsentrasi asetat,
propionat, butirat pada supernatan C. butyricum BCC B2571 adalah sebagai berikut: Perlakuan 1 3,4 mM; 3,0 mM; 2,7 mM, Perlakuan 2 6,8 mM; 6,0 mM; 5,3 mM,
Perlakuan 3 13,6 mM; 12,0 mM; 10,6 mM. Pada supernatan E.recatale DSM 17629 konsentrasinya adalah: Perlakuan 1 3,7 mM; 4,2 mM; 3,6 mM, Perlakuan 2
7,3 mM; 8,4 mM; 7,2 mM, Perlakuan 3 14,7 mM; 16,7 mM; 14,3 mM.
6
dikulturkan di dalam tabung berukuran 75 mL. Setelah kepadatan sel mencapai sekitar 50, kultur
diinkubasi lebih lanjut selama 48 jam dengan atau tanpa perlakuan supernatan. Per- lakuan yang diterapkan berupa Perlakuan 1 dan Perlakuan 2 supernatan C.buty-
ricum BCC B2571 atau E.rectale DSM 17629 seperti disebutkan sebelumnya. Pada akhir masa inkubasi, sel dipanen dengan bantuan tripsin.
3.3.2.2. Penghitungan Jumlah sel
Sel diwarnai dengan tryphan blue 0,1. Jumlah sel hidup dan mati dihitung dengan hemositometer dibawah mikroskop inversi. Penghambatan proliferasi sel
dihitung sebagai berikut: Penghambatan Proliferasi = A-BB x 100
Keterangan: A = jumlah sel hidup kontrol tanpa perlakuan supernatan B = jumlah sel hidup akibat perlakuan supernatan
3.3.2.3.Deteksi Apoptosis
Sel HCT-116 10
4
dikulturkan di dalam 8-well slide chamberselama 24 jam. Media dibuang kemudian diganti dengan media serupa yang sudah dicampur dengan
supernatan yang mengandung SCFA hasil fermentasi RS3. Kontrol berupa sel HCT- 116 yang dikulturkan dengan media yang tidak berisi supernatan hasil fermentasi.
Inkubasi dilanjutkan lagi selama 48 jam. Sel kemudian difiksasi dengan 2 larutan glutaraldehidaselama 1 jam kemudian diwarnai dengan 10 mgL Hoechst 33258
selama 30 menit. Sel segera dicuci dengan phosphate buffer saline PBS. Sel diamati dibawah mikroskop fluoresen pada eksitasi 365 nm dan emisi 460 nm.Sel
mati apoptosis ditandai oleh degradasi kromatin dan pendaran cahaya sangat jelas. Sel apoptosis diamati secara semi kuantitatif dengan cara menetapkan skor berikut: 0
0–1 pendaranlapang pandang, +1 2–4 pendaranlapang pandang, +2 5–6 pendaranlapang pandang dan +3 0 6 pendaran lapang pandang.
3.3.2.4. Real Time Polymerase Chain Reaction RT-PCRUntuk Analisis Ekspresi
Gen Bax dan Bcl-2 3.3.2.4.1. Ekstraksi total mRNA
mRNA diisolasi dari sel HCT-116 dengan bantuan kit komersial RNeasy Kitt, Qiagen mengikuti prosedur yang ditetapkan oleh produsen. Konsentrasi mRNA
kemudian diukur dengan spektrofotometer SmartSpec-Plus, Biorad pada260 nm. Prosedur lengkap ekstraksi mRNA dicantumkan dalam Lampiran 4.
3.3.2.4.2. Analisis RT-PCR
Ekspresi relatif mRNA Bax dan Bcl-2 terhadap house keeping geneGAPDH diukur pada mesin RT-PCR IQ5 Multicolor Real Time PCR Detection System,
Biorad. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen dicantumkan dalam Tabel 7.
Tabel7 Primer untuk amplifikasi gen pada analisis RT-PCR
Kategori