B. Amplifikasi dan Visualisasi DNA
Amplifikasi gen 12S rRNA dan 16S rRNA berhasil dilakukan pada 9 sampel dari 17 sampel yang diamplifikasi. Amplifikasi menggunakan pasangan
primer AF05 dan AF08 berukuran panjang sekitar 1500 pb Gambar 9.
Gambar 9 Visualisasi amplikon gen 12S rRNA dan 16S rRNA pada PAGE 6. Ket: M = Marker, 3-17 = nomor sampel
Sebanyak 9 sampel menampakkan pita DNA target dan dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. Setelah DNA target dijadikan cetakan dalam PCR for
sequencing, maka diperoleh 6 sampel yang terbaca jelas. Keenam sampel tersebut adalah P. leucomystax, P. aspera, O. hosii, F. limnocharis, L. microdiscus, dan R.
margaritifer.
C. Kongruensi Identifikasi Berdasarkan Morfologi dan Genetik
Hasil analisis dengan menghitung jumlah perbedaan nukleotida dan jarak genetik menunjukkan bahwa hasil penentuan spesies berdasarkan data genetik
dapat berbeda dengan data morfologi. Tabel 4 menunjukkan jumlah perbedaan nukleotida dan jarak genetik antara sekuen DNA spesies pada penelitian ini
dengan sekuen referensi dari GenBank. Berdasarkan nilai terendah dari jumlah perbedaan nukleotida dan jarak
genetik, hasil identifikasi yang kongruen antara identifikasi molekuler dan morfologi adalah pada spesies P. leucomystax, P. aspera, L. microdiscus dan R.
margaritifer. Hasil identifikasi yang tidak kongruen adalah spesies F. limnocharis, sedangkan spesies O. hosii belum dapat dipastikan karena kualitas
data kurang.
1500 pb 3 5 7 8 10 11 12 16 17
Tabel 4. Jumlah perbedaan nukleotida bawah diagonal dan jarak genetik atas diagonal berdasarkan gen 12S rRNA dan 16S rRNA antar sampel berudu
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11 12
13 14
15 16
17 18
19 20
21 22
1 B. japonicus
11
- 0.12
0.20 0.34
0.34 0.30
0.30 0.38
0.32 0.25
0.30 0.31
0.33 0.29
0.35 0.33
0.14 0.36
0.34 0.50
0.34 0.77
2 B. melanostictus
12
35 -
0.22 0.35
0.40 0.31
0.31 0.40
0.34 0.24
0.31 0.32
0.30 0.32
0.37 0.34
0.16 0.35
0.38 0.50
0.36 0.75
3 H. japonica
13
57 61
- 0.34
0.32 0.28
0.29 0.31
0.34 0.12
0.26 0.27
0.31 0.30
0.36 0.38
0.22 0.37
0.33 0.41
0.35 0.87
4 F. cancrivora
2
88 91
88 -
0.21 0.23
0.24 0.38
0.31 0.38
0.33 0.30
0.25 0.25
0.21 0.43
0.35 0.42
0.36 0.48
0.20 0.88
5 F. limnocharis
1
88 99
84 60
- 0.24
0.27 0.33
0.31 0.40
0.30 0.30
0.26 0.28
0.18 0.46
0.36 0.44
0.32 0.44
0.18 0.96
6 L. bannaensis
9
82 82
77 65
67 -
0.24 0.28
0.26 0.31
0.27 0.24
0.09 0.24
0.25 0.40
0.33 0.40
0.30 0.35
0.25 0.88
7 R. plancyi
5
80 82
78 68
73 66
- 0.27
0.25 0.32
0.27 0.19
0.24 0.02
0.28 0.40
0.33 0.39
0.27 0.35
0.28 0.84
8 P. megacephalus
4
97 101
82 97
87 76
73 -
0.28 0.33
0.28 0.28
0.27 0.27
0.32 0.44
0.42 0.43
0.27 0.11
0.32 0.83
9 R. schlegelii
3
85 88
89 82
82 72
69 76
- 0.31
0.31 0.25
0.28 0.25
0.30 0.35
0.36 0.34
0.21 0.32
0.29 0.82
10 H. chinensis
14
69 67
36 96
100 82
84 88
83 -
0.33 0.29
0.33 0.32
0.37 0.36
0.24 0.36
0.32 0.40
0.36 0.76
11 M. ornata
7
81 82
71 87
81 74
75 77
83 86
- 0.17
0.27 0.27
0.35 0.38
0.32 0.37
0.31 0.38
0.35 0.83
12 K. pulchra
8
84 85
75 80
80 67
55 77
70 78
49 -
0.27 0.18
0.31 0.40
0.31 0.38
0.28 0.32
0.31 0.83
13 L. fujianensis
10
87 81
82 70
71 29
66 75
77 88
75 73
- 0.24
0.24 0.40
0.35 0.41
0.31 0.36
0.24 0.87
14 R. nigromaculata
6
79 85
79 70
75 68
6 74
69 85
73 53
68 -
0.29 0.39
0.34 0.39
0.26 0.35
0.29 0.81
15 F. iskandari
15
90 94
91 59
52 70
77 85
80 94
90 83
68 79
- 0.41
0.38 0.44
0.31 0.46
0.01
0.89 16
L. hasseltii
16
88 89
96 107
110 100
100 108
92 93
96 100
101 98
103 -
0.35 0.03
0.36 0.52
0.41 0.51
17 P. aspera
17
41 46
62 91
92 86
87 104
92 67
84 83
92 89
96 90
- 0.36
0.37 0.52
0.38 0.81
18 O. hosii
20
93 90
95 105
108 101
99 107
89 92
95 96
103 98
107 9
92 -
0.36 0.50
0.44 0.47
19 R. javanus
19
90 97
87 93
86 81
75 74
61
86 82
77 82
73 83
93 96
94 -
0.31 0.31
0.82 20
P. leucomystax
18
118 118
102 114
106 91
92 34
85 101
97 85
94 92
110 121
121 119
83 -
0.45 0.93
21 F. limnocharis
22
89 93
90 58
51 69
76 84
79 93
90 83
67 78
3 103
96 107
83 109
- 0.89
22 L. microdiscus
21
158 155
167 169
176 168
165 164
163 156
164 163
168 162
170 121
162 115
163 174
170 -
Keterangan: No. akses GenBank mengikuti Tabel 2 Angka bercetak tebal adalah jumlah perbedaan nukleotida dan jarak genetik terkecil antara spesies yang diperbandingkan
24
D. Rekonstruksi Filogeni
Urutan basa nukleotida yang analisis berjumlah 1362 nt, terdiri dari 504 nt gen 12S rRNA dan 858 nt gen 16S rRNA. Pada rekonstruksi filogeni berdasarkan
gen 12S rRNA, spesies P. leucomystax tidak disertakan dalam analisis karena jumlah nukleotida spesies tersebut dalam penelitian ini sangat pendek 20 nt.
Tabel 5 menunjukkan nilai konsistensi dan kestabilan pohon filogeni yang direkonstruksi berdasarkan masing-masing gen dan gabungan gen 12S dan 16S
rRNA selanjutnya disimbolkan dengan 12S-16S rRNA. Berdasarkan tabel tersebut, nilai CI dan RI hasil rekonstruksi filogeni berdasarkan gen 16S rRNA
tertinggi di antara dua rekonstruksi lainnya. Hal ini menujukkan bahwa pohon filogeni berdasarkan gen 16S rRNA merupakan pohon filogeni yang paling
konsisten dan stabil. Tabel 5. Nilai CI Consistency Index, RI Retention index, RC Rescaled
consistency index ketiga pohon filogeni Anura
Gen CI
RI RC
12S rRNA 0.4540
0.5702 0.2589
16S rRNA
0.5169 0.6103
0.3155 12S-16S rRNA
0.4786 0.5667
0.2713 Hasil rekonstruksi filogeni menghasilkan topologi yang yang berbeda pada
gen 12S rRNA Gambar 10a. Topologi pohon berdasarkan gen 16S rRNA Gambar 10b sama dengan topologi pohon berdasarkan gen 12S-16S rRNA
Gambar 11, di mana posisi basal ditempati oleh kelompok Rhacophorid dan posisi terluar ditempati oleh kelompok Bufonid. Posisi basal topologi pohon
filogeni gen 12S rRNA ditempati oleh kelompok Dicroglossid dan posisi terluar ditempati oleh kelompok Ranid.
Kesamaan dari ketiga pohon filogeni tersebut adalah Bufonid berkelompok dengan Hylid dalam satu kelompok monofiletik. Kelompok-kelompok
monofiletik lainnya antara lain Mycrohylid dan Ranid. Dicroglossid merupakan kelompok monofiletik pada topologi pohon gen 16S rRNA dan gen 12S-16S
rRNA sedangkan berdasarkan gen 12S rRNA kelompok tersebut terpisah pada 2 kelompok, yaitu kelompok genus Fejervarya dan kelompok genus Limnonectes.
Pada ketiga topologi pohon filogeni, kelompok Rhacophorid terpisah secara
parafiletik. Genus Polypedates membentuk cabang monofiletik dan berhubungan dekat dengan Rhacophorus.
Pada ketiga rekonstruksi filogeni, spesies L. microdiscus, L. hasseltii dan O. hosii selanjutnya disebut kelompok Megophryid membentuk kelompok
monofiletik dengan dukungan bootstrap 90, sedangkan spesies F. limnocharis menempati posisi lebih dekat dengan F. iskandari pada kelompok Dicroglossid
dengan dukungan bootstrap 100. Spesies P. aspera menempati posisi lebih dekat dengan genus Bufo berdasarkan gen 12S rRNA dan gen 16S rRNA,
sedangkan berdasarkan gen 12S-16S rRNA spesies ini menempati posisi lebih dekat dengan spesies B. japonicus dengan dukungan bootstrap rendah 50.
Posisi basal kelompok Rhacophorid berbeda pada ketiga topologi pohon. Spesies R. schlegelii menempati posisi basal Rhacophorid berdasarkan gen 12S
rRNA, spesies anggota genus Polypedates menempati posisi basal berdasarkan gen 16S rRNA, sedangkan berdasarkan gen 12S-16S rRNA posisi basal
Rhacophorid ditempati oleh R. javanus.
a b
Gambar 10 Hasil rekonstruksi filogeni dengan metode Maximum Parsimony berdasarkan: a gen 12S rRNA, b gen 16S rRNA.
Bufonid Ranid
Rhacophorid Hylid
Microhylid
Dicroglossid Ranid
Bufonid
Dicroglossid Microhylid
Hylid
Rhacophorid Dicroglossid
Megophryid
Megophryid
Gambar 11 Hasil rekonstruksi filogeni dengan metode Maximum Parsimony berdasarkan gen 12S dan 16S rRNA.
Bufonid Hylid
Microhylid Ranid
Dicroglossid
Rhacophorid Megophryid
V. PEMBAHASAN
A. Kongruensi Identifikasi Morfologi dan Molekuler
Ukuran tubuh sampel berudu O. hosii dan L. microdiscus sekitar 1-2 kali lebih kecil daripada berudu L. hasseltii pada tahap perkembangan yang sama.
Perbedaan ukuran tubuh tersebut diduga sebagai akibat dari perbedaan peletakan telur oleh induk betina. Pada kondisi yang tidak memungkinkan untuk meletakkan
telur di genangan air di lantai hutan, katak betina L. hasseltii dapat meletakkan telur pada tempat lain seperti di tepi sungai berarus lambat atau tenang. Fenomena
seperti ini juga terlihat pada jenis katak pohon Kusrini et al. 2009. Berudu yang hidup pada kolam temporer, misal genangan air, akan lebih cepat tumbuh dan
bermetamorfosis dibandingkan dengan berudu yang hidup pada kolam permanen, misal sungai. Hal ini dikarenakan kolam temporer memiliki kelebihan dalam hal
potensi pakan Wassersug 1975; Wilbur 1987 dengan lebih sedikit jumlah predator Brendonck et al. 2002; Petranka Kennedy 1999. Sifat sementara dari
kolam menguntungkan dari aspek tersebut namun mengharuskan berudu untuk bermetamorfosis pada waktu tertentu.
Formula geligi O. hosii berbeda satu baris pada geligi atas dengan L. hasseltii. Iskandar 1998 menyebutkan bahwa pada berudu terdapat variasi
formula geligi dalam satu spesies yang sama. Formula geligi berudu sempurna pada awal fase larva, namun proporsi relatif formula geligi dan oral disc terus
berubah selama metamorfosis. Pada berudu Scaphiopus dan kelompok Ranid jumlah baris geligi bertambah selama metamorfosis Gosner 1960.
Genus Philautus merupakan salah satu Anura yang seluruh fase metamorfosisnya terjadi di dalam telur sehingga pada akhir metamorfosis telur
menetaskan katak muda Inger 1996. Metamorfosis pada spesies P. vittiger diketahui memiliki berudu yang hidup bebas di dalam air Kusrini et al. 2008,
sehingga pengelompokkan spesies ini perlu dipelajari lebih lanjut untuk memastikan posisinya dalam taksonomi Anura.
Pada awal perkembangannya, data molekuler hanya digunakan oleh para taksonomis sebagai alat untuk mempelajari kekerabatan antar taksa dan proses
evolusi sebuah kelompok organisme. Namun, saat ini data molekuler telah
Kategori