C. Deskripsi Morfologi
Pengamatan morfologi berupa pola warna tubuh dan ekor, letak mata, nostril, anal, mulut dan geligi dilakukan dengan mikroskop stereo. Pengukuran
morfometri seluruh individu berudu dilakukan untuk mendapatkan variasi ukuran tubuh berudu. Tahap perkembangan berudu ditentukan berdasarkan Gosner
1960. Terminologi dan pengukuran morfometri berudu dilakukan berdasarkan Altig 2007, yaitu: BL - body length, IND - internarial distance, IOD -
interorbital distance, LB - limb bud, MTH - maximum tail height, OD - oral disc, SP - spiracle, TAL - tail length, TL - total length, TMA
– tail muscle axis, TMH - tail muscle height, TMW - tail muscle width, and VT - vent tube Gambar 8.
Gambar 8. Terminologi dan morfometrika berudu; A dorsal dan B lateral
D. Ekstraksi dan Isolasi DNA
Isolasi DNA total dilakukan mengikuti metode Farajallah 2002. Potongan otot berudu sepanjang ± 2 mm dalam alkohol 70 dicuci dengan 500 µl
buffer TE sebanyak 2 kali. Sampel yang telah dicuci tersebut kemudian dihancurkan menggunakan gunting dalam buffer 1×STE 300 µl. Penghancuran
protein dilakukan dengan menambahkan enzim Proteinase-K sebanyak 20 µl dan 10 SDS sebanyak 50 µl. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu
55 C selama 1 jam sambil dikocok perlahan.
Material DNA dipisahkan dari material organik lainnya dengan metode ekstraksi fenol, yaitu dengan menambahkan larutan NaCl 5M sebanyak 50 µl,
fenol sebanyak 400 µl dan kloroform-isoamil alkohol CIAA; 24:1 sebanyak 400
µl. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang sambil dikocok pelan selama 1 jam. Bahan organik yang masuk ke fase fenol dipisahkan dari fase
air dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Fase air yang terbentuk di lapisan atas kemudian dipindahkan ke dalam tabung baru. DNA
dimurnikan dengan teknik pengendapan alkohol yaitu dengan menambahkan alkohol absolut sebanyak 2× volume fase air yang dipindahkan dan NaCl 5M
sebanyak 110 × volume fase air yang dipindahkan. Campuran diinkubasi pada suhu 4
C selama 24 jam. Molekul-molekul DNA diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Endapan DNA yang diperoleh
kemudian dicuci dengan alkohol 70. Setelah alkohol pencuci dibuang dan dievaporasi dalam ruang vakum selama 30 menit, molekul-molekul DNA
disuspensikan dalam buffer TE 80 dan disimpan dalam freezer untuk digunakan lebih lanjut.
E. Amplifikasi Perbanyakan Ruas DNA
Ruas DNA diamplifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction PCR menggunakan mesin Thermo Cycler TaKaRa MP4. Primer yang digunakan
adalah AF05 5’-ACTGGGATTAGATACCCCACTAT dan AF08 5’-
ATGTTTTTGGTAAACAGGCG. Primer AF05 menempel pada bagian tengah gen 16S rRNA dan AF08
menempel pada bagian akhir gen 12S rRNA. Kedua gen tersebut mengapit ruas DNA sebesar 1474 pb atau setara dengan posisi nukleotida 505 sampai dengan
1978 genom mitokondria Dogania subplana Farajallah 2002. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 25µl dengan komposisi 2 µl cetakan
DNA, Distilated water steril 15.3 µl, primer 10 ρmol µl masing-masing 1 µl,
dNTP 2.5mM sebanyak 1.5 µl, MgCl
2
sebanyak 1.5 µl dan Taq Polymerase 1.25 uµl sebanyak 0.2 µl beserta bufernya sebanyak 2.5 µl. Amplifikasi DNA
dilakukan dalam kondisi suhu pre-denaturasi 94 C selama 4 menit, dilanjutkan
dengan 30 siklus yang terdiri dari denaturasi 94 C selama 1 menit, penempelan
55 C selama 1 menit 30 detik, pemanjangan 72
C selama 1 menit dan pemanjangan akhir 72
C selama 7 menit.
F. Visualisasi Perbanyakan Ruas DNA
Kategori