F. Visualisasi Perbanyakan Ruas DNA
Amplikon diuji menggunakan metode elektroforesis gel poliakrilamid PAGE 6 yang dijalankan pada tegangan 200 V selama 35 menit atau sampai
pewarna bromthymol blue mencapai bagian bawah gel. Setelah pemisahan elektroforesis, pita-pita DNA divisualisasi dengan pewarnaan perak silver
staining Tegelstrom 1986.
G. Perunutan Sequencing DNA Produk PCR
Perunutan merupakan tahap akhir untuk memperoleh data runutan nukleotida dari ruas DNA amplikon. Perunutan DNA dilakukan menggunakan
jasa pelayanan sekuensing dari PT. Macrogen Inc. Perunutan tersebut dilakukan menggunakan pasangan primer yang digunakan pada saat PCR.
H. Analisis Data
Morfologi berudu masing-masing spesies disajikan dalam bentuk deskripsi. Urutan nukleotida yang diperoleh dari proses perunutan diedit secara
manual berdasarkan kromatogram menggunakan program BioEdit Sequence Alignment Editor 6.32. Runutan nukleotida yang telah diedit kemudian
disejajarkan bersama beberapa spesies Anura lainnya yang diakses dari GenBank dengan nomor akses terdapat pada Tabel 2. Proses penyejajaran dilakukan dengan
program Clustal W kemudian diedit secara manual. Analisis jumlah perbedaan nukleotida, jarak genetik dengan model Kimura
2 Parameter K2P dan rekonstruksi filogeni dilakukan menggunakan program
MEGA version 4 Tamura et al. 2007.
Rekonstruksi filogeni dilakukan dengan metode Maximum Parsimony MP berdasarkan gen 12S rRNA, 16S rRNA dan gabungan antara 12S dan 16S
rRNA selanjutnya disimbolkan dengan gen 12S-16S rRNA. Outgroup yang digunakan dalam rekonstruksi filogeni adalah Crocodylus porosus. Analisis
bootstrap 1000 kali dilakukan untuk menguji tingkat kepercayaan dari sebuah titik cabang dalam topologi pohon filogeni.
Tabel 2. Daftar spesies, wilayah sebaran dan nomor akses GenBank yang digunakan dalam analisis keragaman nukleotida dan rekonstruksi filogeni
No Spesies
No. Akses Sebaran IUCN 2012
Outgroup
Crocodylus porosus DQ273698
Ingroup 1
Fejervarya limnocharis NC005055
Asia Selatan dan Asia Tenggara termasuk Indonesia
2 Fejervarya cancrivora
NC012647 Cina Selatan, Asia Tenggara termasuk
Indonesia 3
Rhacophorus schlegelii NC007178
Jepang 4
Polypedates megacephalus NC006408
Cina dan India 5
Rana plancyi NC009264
Cina bagian timur 6
Rana nigromaculata NC002805
Rusia, Cina, Korea, Jepang 7
Microhyla ornata NC009422
Asia selatan 8
Kaloula pulchra NC006405
Asia Tenggara, Asia Selatan Cina 9
Limnonectes bannaensis NC012837
- 10
Limnonectes fujianensis NC007440
Cina bagian tengah dan selatan 11
Bufo japonicus NC009886
Endemik Jepang 12
Bufo melanostictus NC005794
Asia Selatan, Cina, Asia Tenggara termasuk Indonesia
13 Hyla japonica
NC010232 Jepang, Cina, Korea
14 Hyla chinensis
NC006403 Cina bagian tengah
15 Fejervarya iskandari
AB526324 16
Limnonectes hasseltii AB646408
17 Phrynoidis aspera
Dalam penelitian ini 18
Polypedates leucomystax Dalam penelitian ini
19 Rhacophorus javanus
Dalam penelitian ini 20
Odorana hosii Dalam penelitian ini
21 Limnonectes microdiscus
Dalam penelitian ini 22
Fejervarya limnocharis Dalam penelitian ini
IV. HASIL
Kategori