Bahan dan Alat Tahap Penelitian

3. METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2008 sampai dengan November 2008 di Laboratorium Biokimia Hasil Perikanan, Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan dan Laboratorium Uji Biofarmaka Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah keong matah merah Cerithidea obtusa yang diperoleh dari pasar Muara Angke, Jakarta. Tiga jenis pelarut yang digunakan dalam ekstraksi, yaitu metanol pelarut polar, etil asetat pelarut semipolar, dan n-heksana pelarut nonpolar. Bahan kimia yang dipakai dalam uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH, butylated hydroxytoluene BHT sebagai standar, dan metanol pro analisis sebagai pelarut. Bahan untuk uji fitokimia, yaitu H 2 SO 4, akuades, kloroform p.a pengenceran, anhidra asetat, asam sulfat pekat, HCl 2 N, peraksi Dregendorff, peraksi Wagner, pereaksi Meyer, serbuk magnesium, alkohol, HCl 37 , etanol 95 , etanol 70 , FeCl 3 5 , peraksi Molish, pereaksi benedict, pereaksi biuret, dan larutan ninhidrin 0,1 . Bahan- bahan untuk uji bilangan peroksida yaitu minyak jagung, akuades, twen 80, asam asetat glasial, kloroform, kalium iodida KI, Natrium thiosulsat Na 2 S 2 O 3 , KIO 3 , HCl, dan FeCl 2 . Alat-alat yang dipakai antara lain timbangan digital, mortar, blender, erlenmeyer, sonikator, magnetic stirrer, vacum rotary evaporator, botol ekstrak, kertas saring Whatman 42, inkubator, spektrofotometer UV-visible, sudip, alumunium foil, gelas ukur, tabung reaksi, pipet volumetrik, pipet mikro, tissue dan forteks.

3.3. Tahap Penelitian

Rangkaian kegiatan penelitian dibagi dalam dua tahap, yaitu tahap pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian tahap pendahuluan meliputi ekstraksi komponen antioksidan pada tahap penapisan dan ekstraksi dengan metode bertingkat serta uji aktivitas antoksidan dengan metode DPPH. Penelitian utama meliputi preparasi keong dan analisis proksimat, ekstraksi bahan aktif, uji aktivitas antioksidan, uji fitokimia dan uji bilangan peroksida sebagai indeks kemunduran mutu minyak terhadap emulsi minyak kelapa yang diberi ekstrak terpilih. 3.3.1. Penelitian pendahuluan Penelitian tahap pendahuluan ini bertujuan untuk membandingkan efektivitas metode ekstraksi bertingkat atau terpisah dan jenis pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi. Efektivitas metode ekstraksi dilihat dari jumlah rendemen ekstrak yang dihasilkan dan nilai aktivitas hambatan terhadap radikal bebas melalui uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. 3.3.1.1.Ekstraksi komponen antioksidan tahap penapisan dari keong matah merah Cerithidea obtusa. Tahap penapisan ini, ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut metanol teknis. Sampel keong matah merah ditimbang beratnya 150 gram, kemudian dipotong kecil-kecil, dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Pelarut metanol ditambahkan sampai sampel terendam hingga 300 ml dengan perbandingan bahan dan pelarut 1:1 wv, lalu erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil. Sampel dimaserasi menggunakan shaker selama 24 jam. Setelah 24 jam, larutan ekstrak yang diperoleh disaring dengan kertas saring whatman 42 untuk memisahkan filtrat dan residunya. Filtrat yang didapat dievaporasi pada suhu 37 o C. Ekstrak kasar yang diperoleh dikerok dan dimasukkan ke dalam botol ekstrak kemudian dilakukan analisis yaitu uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Blois 1959 diacu dalam Wikanta et al. 2005. Sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan ekstrak kasar yang diperoleh dihitung nilai rendemennya SNI-19-1705-2000. Keong matah merah Cerithidea obtusa Penimbangan Pemotongan Maserasi selama 24 jam dengan metanol teknis Penyaringan Filtrat Residu Evaporasi Ekstrak metanol Gambar. 3 Diagram alir ekstraksi komponen antioksidan tahap penapisan Pramadhany 2006 yang dimodifikasi waktu maserasinya 3.3.1.2.Ekstraksi komponen antioksidan dari keong matah merah Cerithidea obtusa dengan metode bertingkat. Komponen aktif antioksidan dari keong matah merah Cerithidea obtusa didapatkan dengan ekstraksi pelarut organik. Metode ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini, yaitu ekstraksi bertingkat metode Quinn 1988 diacu dalam Pramadhany 2006 yang dimodifikasi waktu maserasinya. Tujuannya adalah untuk mengekstrak komponen dalam keong sesuai dengan tingkat kepolarannya, sehingga komponen bioaktif yang belum diketahui sifatnya dapat diektrak secara optimal pada salah satu pelarut yang digunakan. Sampel keong sebanyak 150 gram sampel diambil, dipotong kecil-kecil dan dimasukkan dalam erlenmeyer, kemudian diberi pelarut heksana p.a sampai terendam 300 ml dan ditutup dengan alumunium foil. Selanjutnya sampel dimaserasi menggunakan shaker selama 24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan disaring dengan kertas saring Whatman 42 sehingga didapat filtrat dan residu pertama. Filtrat ini selanjutnya disebut filtrat heksana. Residu kemudian dimaserasi kembali menggunakan pelarut etil asetat p.a 300 ml selama 24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan disaring kembali dengan kerta whatman sehingga didapat filtrat dan residu kembali. Filtrat ini selanjutnya disebut filtrat etil asetat. Residu yang tersisa dimaserasi kembali menggunakan pelarut metanol p.a 300 ml selama 24 jam. Larutan yang dihasilkan disaring sehingga didapatkan filtrat dan residu akhir. Filtrat ini selanjutnya disebut filtrat metanol. Filtrat yang diperoleh dari masing-masing dievaporasi dengan evaporator vakum putar dengan suhu 37 o C. Ekstrak kasar yang diperoleh dikerok dan dimasukkan ke dalam botol ekstrak. Filtrat yang dihasilkan dari tiga pelarut kemudian dianalisis aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH Blois diacu dalam Wikanta et al. 2005 yang dimodifikasi konsentrasi ekstraknya. Diagram alir proses ekstraksi komponen antioksidan secara bertingkat ditunjukkan oleh Gambar 4. 3.3.2. Penelitian utama Penelitian yang dilakukan pada penelitian utama adalah preparasi keong, proses ekstraksi, penghitungan rendemen dan aplikasi ekstrak terpilih dalam menghambat oksidasi minyak. Metode ekstraksi terbaik yang didapatkan dari penelitian pendahuluan selanjutnya dipakai dalam penelitian utama ini. Metode ekstraksi yang dipakai dalam penelitian utama adalah ekstraksi tunggal dengan pelarut yang berbeda. Tahap penelitian utama secara lengkap dapat dilihat pada Gambar 5. 3.3.2.1.Preparasi keong matah merah Cerithidea obtusa Keong laut matah merah Cerithidea obtusa diperoleh dari pasar Muara Angke, Jakarta. Keong laut yang didapatkan dalam keadaaan hidup disimpan dalam sterofoam sebagai media transportasi. Daging keong dipisahkan dari cangkang dengan cara memecahkan cangkangnya, setelah daging dan cangkang dapat dipisahkan maka segera dilakukan penimbangan dan disimpan dalam freezer , sampai bahan tersebut akan dianalisis kadar proksimatnya AOAC 1995. Keong matah merah Cerithidea obtusa Penimbangan Pemotongan Maserasi selama 24 jam dengan heksana Penyaringan Filtrat I Residu Evaporasi Maserasi selama 24 jam dengan etil asetat Ekstrak heksana Penyaringan Filtrat II Residu Evaporasi Maserasi selama 24 jam dengan metanol Ekstrak etil asetat Penyaringan Filtrat III Residu Evaporasi Ekstrak metanol Gambar. 4 Diagram alir ekstraksi komponen antioksidan keong Quinn 1988 diacu dalam Pramadhany 2006 yang dimodifikasi waktu maserasinya 3.3.2.2.Ekstraksi bahan aktif dengan pelarut yang berbeda Ekstraksi bahan aktif dilakukan menggunakan pelarut yang berbeda yaitu metanol polar, etil asetat semi polar, dan heksana non polar. Sampel keong ditimbang dengan berat 150 gram, kemudian dipotong kecil-kecil, lalu dimasukkan erlenmeyer. Sampel keong segar kemudian diberi pelarut sampai terendam 300 ml, lalu erlenmeyer ditutup alumunium foil. Sampel dimaserasi dan diaduk menggunakan shaker selama 24 jam. Setelah 24 jam, larutan ekstrak yang diperoleh disaring dengan kertas whatman 42 untuk memisahkan filtrat dan residunya. Filtrat dievaporasi dengan evaporator vakum putar pada suhu 37 o C. Ekstrak kasar yang diperoleh dikerok dan dimasukkan ke dalam botol ekstrak, kemudian dianalisis yang meliputi uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Blois diacu dalam Molyneux 2004 yang dimodifikasi konsentrasi ekstraknya. Masing-masing ekstrak kasar yang didapatkan dihitung nilai rendemen ekstrak yang dihasilkan. Ekstrak terpilih yang didapatkan diuji fitokimia Harborne 1984 untuk mengetahui golongan senyawa aktif yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan. 3.3.2.3.Aplikasi ekstrak terpilih dalam menghambat oksidasi Penentuan aktivitas antioksidan dari ekstrak keong matah merah diterapkan pada emulsi minyak. Antioksidan berfungsi untuk menghambat pembentukan peroksida pada minyak. Pengujian ini dilakukan melalui pembuatan minyak kelapa dan sistem emulsinya yang dilanjutkan dengan evaluai aktivitas antioksidan dengan penentuan bilangan peroksida Santoso 2003. 3.3.3. Analisis Analisis yang digunakan dalam penelitian ini adalah perhitungan rendemen, analisis proksimat kadar air, kadar abu, kadar protein dan kadar lemak, uji aktivitas antioksidan, uji fitokimia, dan uji bilangan peroksida. Keong matah merah Cerithidea obtusa Penimbangan 150 g Pemotongan Penambahan pelarut [metanol, etil asetat, heksan masing-masing 150 ml mv] Maserasi selama 24 jam Penyaringan kertas saring Whatman 42 Evaporasi Ekstrak kasar Uji aktivitas antioksidan Ekstrak terpilih Uji fitokimia Aplikasi pada emulsi minyak Analisis bilangan peroksida Gambar. 5 Diagram alir tahapan penelitian utama 3.3.3.1.Perhitungan rendemen Metode yang digunakan untuk perhitungan rendemen ini berdasarkan SNI-19-1705-2000. Rendemen dihitung sebagai persentasi ekstrak kering dari bobot daging awal. Adapun perumusannya adalah sebagai berkut : Rendemen = Bobot ekstrak kering gr x 100 Bobot sampel gr 3.3.3.2. Analisis proksimat 1 Analisis kadar air AOAC 1995 Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan dalam oven pada suhu 102-105 o C selama 10-15 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator kurang lebih 30 menit dan biarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan, kemudian cawan dan daging keong seberat 5 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dipotong kecil-kecil. Masukkan cawan tersebut ke dalam oven dengan suhu 102-105 o C selama 3-5 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan biarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air pada daging keong matah merah Dry basis: Kadar air = B – C x 100 B - A Keterangan : A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan daging keong gram C = Berat cawan dengan daging keong setelah dikeringkan gram 2 Analisis kadar abu AOAC 1995 Cawan abu porselen dimasukkan dalam tungku pengabuan selama kurang lebih 1 jam. Setelah itu cawan abu porselen tersebut didinginkan dalam desikator dan ditimbang berat kosongnya. Daging keong sebanyak 3-5 gram yang telah dipotong kecil-kecil dimasukkan ke dalam cawan abu porselen, kemudian diletakkan dalam tungku pengabuan, dibakar sampai diperoleh abu berwarna abu- abu dan beratnya tetap. Perhitungan kadar abu pada daging keong matah merah : Kadar abu = C – A x 100 B - A Keterangan : A = Berat cawan abu porselen kosong gram B = Berat cawan abu porselen dengan daging keong gram C = Berat cawan abu porselen dengan daging keong setelah dikeringkan gram. 3 Analisis kadar protein AOAC 1995 Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. 1. Tahap destruksi Daging keong ditimbang seberat 0,3 gram untuk daging kering sedangkan untuk daging basah seberat 0,5 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 . Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 o C. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. 2. Tahap destilasi Tahap destilasi terdiri dari 2 tahap yaitu persiapan dan sampel. Tahap persiapan dilakukan dengan membuka kran air kemudian lakukan pengecekan alkali dan air dalam tanki, tabung dan erlenmeyer yang berisi aquades diletakkan pada tempatnya. Tekan tombol power pada kjeltec sistem yang dilanjutkan dengan menekan tombol steam dan tungku beberapa lama sampai air didalam tabung mendidih. Steam dimatikan dan tabung kjeltec dan erlenmeyer dikeluarkan dari alat kjeltec sistem. Tahap sampel dilakukan dengan meletakkan tabung yang berisi daging keong yang sudah didestruksi ke dalam kjeltec sistem beserta erlenmeyer yang diberi asam borat. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlenmeyer yang berisi asam borat mencapai 200 ml. 3. Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan pada erlenmeyer berubah warna menjadi pink. Perhitungan kadar protein pada daging keong matah merah : Nitrogen = ml HCl daging keong – ml HCl blankox 0,1 N HCl x 14 x 100 mg daging keong Kadar Protein = Nitrogen x 6,25 4 Analisis kadar lemak AOAC 1995 Daging keong seberat 5 gram W 1 dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya W 2 dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 70 o C dengan menggunakan pemanas listrik. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Saat destilasi pelarut akan tertampung diruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan W 3 . Perhitungan kadar lemak pada daging keong : Kadar Lemak = W 3 – W 2 x 100 W 1 Keterangan : W 1 = Berat daging keong gram W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak gram W 3 = Berat labu lemak dengan lemak gram 3.3.3.3. Uji aktivitas antioksidan Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH Blois diacu dalam Molyneux 2004. Uji ini dilakukan terhadap ekstrak keong yang didapatkan. Satu ml DPPH ditambah metanol p.a hingga menjadi 4 ml blanko. Sampel ekstrak dibuat dari ekstrak kasar keong dilarutkan dalam metanol p.a dan dibuat dalam berbagai konsentrasi. Ekstrak dibuat dengan konsentrasi ekstrak 50, 100, 500, 1000 dan 2000 ppm. Masing-masing konsentrasi dimasukkan dalam botol coklat lalu ditambahkan larutan DPPH 1 mM sebesar 1 ml sehingga volume total dalam botol coklat menjadi 4 ml. Masing- masing botol tersebut diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit, selanjutnya serapannya diukur dengan spektrofotometer UV-VIS Hitachi U 2800 pada panjang gelombang 517 nm. Hambatan persentase dihitung dengan rumus : Inhibisi = Absorbansi blanko – Absorbansi sampel x 100 Absorbansi blanko Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y= b Lnx + a digunakan untuk mencari Inhibition Concentration 50 IC 50 dengan memasukkan angka 50 sebagai y sehingga didapatkan nilai x sebagai IC 50. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali ulangan. 3.3.3.4. Uji fitokimia Harborne 1984 Uji fitokimia adalah analisa yang mencakup pada aneka ragam senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh mahkluk hidup, yaitu mengenai sturuktur kimia, biosintesa, perubahan metabolisme, penyebaranya secara alamiah dan fungsi biologinya. Alasan dilakukan analisis fitokimia adalah untuk menentukan ciri senyawa yang terdapat dalam suatu bahan yang mempunyai efek racun atau bermanfaat, yang ditunjukkan oleh ekstrak kasar bila diuji dengan sistem biologi Harbone 1987. Identifikasi senyawa kimia yang berperan sebagai antioksidan dalam keong dilakukan terhadap senyawa-senyawa : a Alkaloid Sampel ekstrak sebanyak 0,5 gram dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dregendorff, pereaksi Meyer dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan dan endapan merah sampai jingga dengan pereaksi Dragendorff. Pereaksi Meyer dibuat dengan menambahkan 1,36 HgCl 2 dengan 0,5 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dengan labu takar. Peraksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambah 2,5 gram iodin dan 2 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Peraksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,8 gram bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini berwarna jingga. b Steroid Sampel sebanyak 0,5 gram dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Ditambahkan ke dalamnya 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif. c Flavonoid Sampel sebanyak 0,5 gram ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume yang sama dan ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. d Saponin uji busa Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin. e Fenol Hidrokuinon pereaksi FeCl 3 Sebanyak 1 gram sampel keong diekstrak dengan 20 ml etanol 70 . Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5 . Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. f Uji Molish Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi molish dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan. g Uji Benedict Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Terbentuknya warna hijau, kuning, atau endapan merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi h Uji Biuret Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 4 ml pereaksi biuret. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil larutan berwarna ungu menunjukkan hasil uji positif adanya peptida. i Uji Ninhidrin Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1 . Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Terjadinya larutan berwarna biru menunjukkan reaksi positif terhadap adanya asam amino. 3.3.3.5. Uji bilangan peroksida a Pembuatan minyak kelapa dan sistem emulsinya Santoso 2003 Minyak yang digunakan dalam penelitian dibuat dari parutan kelapa yang diperas untuk diambil santan kentalnya. Santan kental tersebut dipanaskan dengan cara direbus untuk memisahkan komponen minyak yang terkandung di dalamnya, kemudian dilakukan penyaringan untuk memisahkan minyak dan ampas parutan kelapa. Filtrat yang dihasilkan kemudian disaring lagi dengan kertas Whatman agar diperoleh minyak kelapa yang bening. Sistem emulsi minyak dibuat dengan mengacu pada metode Santoso 2003 yang dimodifikasi, yaitu dengan menghomogenkan 3 minyak kelapa dan 97 air yang mengandung 0,3 Tween 20. b Penentuan bilangan peroksida Santoso 2003 Bilangan peroksida ditentukan berdasarkan jumlah iodin yang dibebaskan setelah lemak atau minyak ditambahkan kalium iodida KI. Bilangan peroksida adalah nilai terpenting untuk menentukan derajat kerusakan pada minyak atau lemak Ketaren 1986. Sistem emulsi lemak ditambahkan ekstrak terbaik dari tahap sebelumnya sebanyak 10 mg, 15 mg, dan 20 mg yang selanjutnya disebut sampel minyak. Sampel minyak ditimbang sebanyak 5 gram di dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 30 ml pelarut yang terdiri dari 60 asam asetat glasial dan 40 kloroform. Minyak yang telah larut ditambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh dan didiamkan 2 menit dalam ruang gelap sambil dikocok. Iod yang terbentuk dititrasi dengan larutan Na 2 S 2 O 3 0,1 N dengan indikator pati 1. Titrasi dihentikan saat larutan sampel menjadi tidak berwarna. Hasil pengurangan volume akhir terhadap volume awal larutan Na 2 S 2 O 3 0,1 N yang ditunjukkan oleh skala pada burret, merupakan volume total larutan Na 2 S 2 O 3 0,1 N yang digunakan untuk titrasi sampel. Cara yang sama juga dibuat untuk penerapan blanko. Nilai bilangan peroksida dinyatakan dengan milliequivalen oksigen per 1000 gram minyak atau lemak Ketaren 1986, yaitu dengan rumus : Meq 1000 g sampel = a-b x N x 1000 G Keterangan : a = jumlah ml larutan Na 2 S 2 O 3 untuk titrasi sampel b = jumlah ml larutan Na 2 S 2 O 3 untuk titrasi blanko N = normalitas larutan Na 2 S 2 O 3 G = berat sampel gram

3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Steel dan Torrie 1980