2.6. Daya Antioksidatif
2.6.1. Mekanisme aktivitas antioksidan Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama
merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan AH yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai
antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida R, ROO atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara
turunan radikal antioksidan A tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu
memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih
stabil Gordon,1990. Penambahan antioksidan AH primer dengan konsentrasi rendah pada
lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak. Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi
maupun propagasi Gambar 2. Radikal-radikal antioksidan A yang terbentuk pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat
bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru Gordon, 1990. Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipida dilihat
pada Gambar 2. Inisiasi
: R + AH ——— RH + A Propagasi : ROO + AH —— ROOH + A
Keterangan : R da ROO adalah radikal lipid
Gambar 2. Reaksi penghambatan antioksidan primer
terhadap radikal lipida Gordon 1990
Mekanisme penghambatan oksidasi lemak oleh antioksidan yaitu dengan mengurangi peroksida yang dapat merangsang terjadinya proses ketengikan yang
terbentuk pada permulaan autooksidasi. Kemungkinan lain, antioksidan akan dioksidasi langsung dan saling mempengaruhi dengan peroksida, sehingga dengan
demikian mencegah oksidasi langsung atau tidak langsung dengan memutuskan rantai reaksi pambentukan gugus peroksida Goutara et al. 1980. Kemungkinan
selanjutnya, molekul aktif dari lemak bereaksi dengan oksigen menghasilkan peroksida aktif. Peroksida aktif memberikan energinya lagi kepada molekul
lemak yang lain sehingga terbentuk reaksi berantai. Dengan adanya zat penghambat oksidasi antioksidan, sejumlah peroksida yang aktif dipisahkan dari
rantai reaksi dengan memindahkan energinya kepada antioksidan. Molekul aktif akan teroksidasi dan menjadi tidak aktif lagi karena lemahnya pemindahan energi
kepada molekul lemak Goutara et al. 1980. Antioksidan selain dapat menghambat proses oksidasi pada lemak, juga
dapat menghambat oksidasi pada bahan lain yang mengandung persenyawaan tidak jenuh yang berada dalam makanan seperti vitamin A. Sifat dari antioksidan
mudah teroksidasi, sehingga sebelum bahan berlemak teroksidasi maka oksigen terlebih dahulu diikat oleh antioksidan Jacobs 1951 dalam Goutara et al. 1980.
2.6.2. Uji aktivitas antioksidan Adanya senyawa antioksidan dapat diketahui melalui uji aktivitas
antioksidan. Prinsipnya adalah evaluasi terhadap adanya aktivitas penghambatan proses oksidasi oleh senyawa-senyawa antioksidan yang terdapat dalam bahan
pangan atau contoh ekstrak bahan alam. Metode yang umum dipakai adalah dengan menggunakan radikal bebas
diphenyl-picrylhydrazyl DPPH yang nantinya akan bereaksi dengan senyawa
antioksidan menghasilkan
diphenylpycrilhydrazine non
radikal yang
diindikasikan dengan perubahan warna ungu menjadi kuning pucat Molyneux 2004. DPPH adalah radikal bebas yang bersifat stabil dan
beraktivitas dengan cara mendelokalisasi elektron bebas pada suatu molekul, sehingga molekul tersebut tidak reaktif sebagaimana radikal bebas yang lain.
Proses delokalisasi ini ditunjukkan dengan adanya warna ungu violet pekat yang dapat dikarakterisasi pada pita absorbansi dalam pelarut etanol pada panjang
gelombang 520 nm Molyneux 2004. Senyawa antioksidan akan bereaksi dengan radikal DPPH melalui mekanisme donasi atom hidrogen dan
menyebabkan warna DPPH dari ungu menjadi kuning yang diukur pada panjang gelombang 517 nm.
Parameter untuk menginterpretasikan hasil pengujian dengan metode DPPH adalah IC
50
inhibition concentration. IC
50
merupakan konsentrasi larutan substrat atau sampel yang akan menyebabkan reduksi terhadap aktivitas DPPH
sebesar 50 Molyneux 2004.
3. METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2008 sampai dengan November 2008 di Laboratorium Biokimia Hasil Perikanan, Laboratorium
Bioteknologi Hasil Perairan dan Laboratorium Uji Biofarmaka Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah keong matah merah Cerithidea obtusa yang diperoleh dari pasar Muara Angke, Jakarta.
Tiga jenis pelarut yang digunakan dalam ekstraksi, yaitu metanol pelarut polar, etil asetat pelarut semipolar, dan n-heksana pelarut nonpolar. Bahan
kimia yang dipakai dalam uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
DPPH, butylated hydroxytoluene BHT sebagai standar, dan metanol pro analisis sebagai pelarut. Bahan untuk uji fitokimia, yaitu
H
2
SO
4,
akuades, kloroform p.a pengenceran, anhidra asetat, asam sulfat pekat, HCl 2 N, peraksi Dregendorff, peraksi Wagner, pereaksi Meyer, serbuk
magnesium, alkohol, HCl 37 , etanol 95 , etanol 70 , FeCl
3
5 , peraksi Molish, pereaksi benedict, pereaksi biuret, dan larutan ninhidrin 0,1 . Bahan-
bahan untuk uji bilangan peroksida yaitu minyak jagung, akuades, twen 80, asam asetat glasial, kloroform, kalium iodida KI, Natrium thiosulsat Na
2
S
2
O
3
, KIO
3
, HCl, dan FeCl
2
. Alat-alat yang dipakai antara lain timbangan digital, mortar, blender,
erlenmeyer, sonikator, magnetic stirrer, vacum rotary evaporator, botol ekstrak, kertas saring Whatman 42, inkubator, spektrofotometer UV-visible, sudip,
alumunium foil, gelas ukur, tabung reaksi, pipet volumetrik, pipet mikro, tissue dan forteks.
3.3. Tahap Penelitian
Rangkaian kegiatan penelitian dibagi dalam dua tahap, yaitu tahap pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian tahap pendahuluan meliputi
ekstraksi komponen antioksidan pada tahap penapisan dan ekstraksi dengan metode bertingkat serta uji aktivitas antoksidan dengan metode DPPH. Penelitian
Kategori