Fraksi Tidak Tertahan FTT

a. Fraksi Tidak Tertahan FTT

Fraksi pertama dinamakan Fraksi Tidak Tertahan FTT karena mengandung senyawa-senyawa yang tidak ditahan oleh fase diam SPE C18 yaitu senyawa-senyawa yang sangat polar. Kromatogram fraksi ini baik pada ulangan 1 Gambar 6 maupun ulangan 2 Gambar 7 menunjukkan bahwa pemisahan senyawa-senyawa yang ada tidak optimal sehingga peak tidak tajam yang kemungkinan dalam 1 peak yang melebar terdapat lebih dari 1 senyawa. Hal ini dapat disebabkan oleh teknik fraksinasi dengan SPE yang kurang optimal seperti penggunaan fase diam yang terlalu tidak polar C18 sehingga senyawa- senyawa polar yang banyak terdapat pada fraksi tidak dapat ditahan. Hasil identifikasi MSMS menunjukkan pada fraksi ini terdapat sekitar 20 senyawa 20 senyawa pada ulangan 1 dan 18 senyawa pada ulangan 2. Senyawa- senyawa ini diduga merupakan peptida dengan berat molekul berkisar dari 262.0 hingga 476.1 Dalton Tabel 5. Jenis peptida yang ada pada ulangan 1 dan 2 berbeda-beda, hanya 4 jenis peptida yang diduga ada pada kedua ulangan yaitu peptida berberat molekul 430.0 15.6 – 16.1 menit yang mengandung Met, 375.1 26.7 – 27.7 menit yang mengandung LeuIle, Asp, Glu, 476.1 32.0 – 32.6 menit yang mengandung LeuIle, Val, Asp dan 375.1 44.7 – 45.3 menit yang mengandung LeuIle, Glu dan Asp. Dua dari peptida-peptida ini diduga mempunyai rasa gurih karena kedua peptida ini mengandung Glu dan Asp yang diduga mempunyai peranan terhadap pembentukan rasa gurih dari suatu peptida Nakata et al. 1995. Peptida lainnya yang diduga mempunyai rasa gurih adalah peptida dengan berat molekul 444.0 17.3 menit dan 444.1 17.9 menit pada ulangan 1 serta peptida berberat molekul 425.0 16.8 menit pada ulangan 2. Ketiga peptida tersebut teridentifikasi mengandung Glu dan Asp Tabel 5 dan Lampiran 8 dan 9. Dari sekitar 20 jenis peptida yang diidentifikasi, hanya 2 jenis peptida yang dapat diidentifikasi kandungan asam aminonya secara lengkap yaitu peptida berberat molekul 375.1 dengan waktu retensi 27.7 menit pada ulangan 1 dan 26.7 Gambar 6 Kromatogram FTT hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1ikan asin jambal roti goreng 14 mgml menggunakan kolom C8, elusi gradien 2 ACN yang mengandung 0.1 asam format hingga 50 ACN yang mengandung 0.1 asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 mlmenit. Gambar 7 Kromatogram FTT hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng 16.3 mgml menggunakan kolom C8, elusi gradien 2 ACN yang mengandung 0.1 asam format hingga 50 ACN yang mengandung 0.1 asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 mlmenit. Tabel 5 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada FTT Fraksi 1 ulangan 1 dan 2 Ulangan 1 Ulangan 2 No. peak Massa MS1 Waktu Retensi menit Dugaan kandungan asam amino No. peak Massa MS1 Waktu Retensi menit Dugaan kandungan asam amino 1. 323.6 10.8 - 1. 426.1 10.6 - 2. 390.1 11.7 Lys 2. 275.7 12.7 Val, LeuIle 3. 262.0 12.5 - 3. 449.0 13.9 Val, Pro 4. 283.9 13.6 Val 4. 406.1 14.2 Val, Pro 5. 430.1 14.6 Val , Pro 5. 288.9 14.4 Val, Glu 6. 430.0 16.1 Met 6. 361.0 14.8 Met, Pro 7. 444.0 17.3 Glu, Asp 7. 430.1 15.6 Met 8. 444.1 17.9 Glu, Asp 8. 425.0 16.8 Glu, Asp 9. 361.0 18.9 LeuIle, Glu 9. 392.0 17.5 LysGln 10. 431.1 19.6 LeuIle 10. 476.1 18.1 - 11. 431.1 22.0 LeuIle 11. 389.1 18.8 Met, LeuIle 12. 473.1 27.2 LeuIle, Asp-Asp 12. 431.1 21.2 LeuIle 13. 375.1 27.7 LeuIle, Glu, Asp 13. 375.1 26.7 LeuIle, Asp, Glu 14. 432.1 31.6 Cys, Val, LeuIle 14. 476.0 28.9 LeuIle, Val 15. 476.1 32.6 LeuIle, Val, Asp 15. 476.1 32.0 LeuIle 16. 476.1 32.9 Met, LeuIle 16. 387.2 34.5 LeuIle 17. 357.0 42.2 Pro, LeuIle 17. 322.1 41.7 LeuIle 18. 476.1 43.2 2 LeuIle 18. 375.1 45.3 LeuIle, Glu, Asp 19. 375.1 44.7 LeuIle, Glu, Asp 20. 375.1 47.2 LeuIle, Asp, Glu diduga kandungan asam amino telah teridentifikasi dengan lengkap menit pada ulangan 2. Peptida dengan berat molekul yang sama, teridentifikasi pada waktu retensi yang lebih lama yaitu 44.7 menit pada ulangan 1 dan 45.3 menit pada ulangan 2. Kandungan asam amino kedua jenis peptida ini sama yaitu LeuIle, Glu dan Asp. Berat molekul asam amino Leu tidak dapat dibedakan dengan Ile karena kedua senyawa tersebut mempunyai berat molekul yang sama isomer. Diduga, kedua peptida tersebut mempunyai kandungan asam amino yang sama sehingga mempunyai berat molekul yang sama, akan tetapi urutan asam aminonya berbeda sehingga berpengaruh terhadap waktu retensi masing- masing peptida. Dugaan ini didasarkan adanya pola fragmentasi ion yang berbeda pada kedua peptida tersebut, seperti yang terlihat pada Lampiran 10. Peptida dengan waktu retensi sekitar 26.7 dan 27. 7 menit mempunyai base peak pada mz 376.1 sedangkan peptida dengan waktu retensi 44.7 dan 45.3 menit mempunyia base peak pada mz 247.0. b. Fraksi A Fraksi berikutnya adalah Fraksi A yang mengandung senyawa-senyawa yang sangat polar karena dielusi menggunakan air bebas ion. Pemisahan senyawa-senyawa yang ada pada fraksi ini, baik pada ulangan 1 maupun ulangan 2, juga tidak optimal seperti pada FTT Gambar 8 dan 9. Bentuk peak yang melebar dan tidak tajam menunjukkan bahwa kemungkinan terdapat lebih dari satu senyawa pada masing-masing peak yang tidak dapat dipisahkan dengan sistem gradien yang diterapkan pada LC. Diduga senyawa-senyawa yang ada pada Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti merupakan senyawa-senyawa yang sangat polar sehingga mempunyai waktu retensi yang hampir bersamaan. Kandungan senyawa, yang diduga peptida, pada fraksi ini berbeda antara ulangan 1 dengan ulangan 2. Pada ulangan 1 terdapat 26 senyawa, sedangkan pada ulangan 2 terdapat 18 senyawa Tabel 6. Perbedaan ini dapat disebabkan oleh perbedaan waktu penyimpanan ikan asin jambal roti sehingga penguraian protein menjadi peptida-peptida juga berbeda. Semakin banyak jumlah peptida berberat molekul kecil menunjukkan semakin banyaknya protein yang diuraikan yang sebanding dengan lamanya waktu penyimpanan. Dari sekian banyaknya peptida yang terkandung pada Fraksi A, hanya 2 jenis peptida yang terdapat pada kedua ulangan yaitu peptida berberat molekul 356.1 dengan waktu retensi 12.0 menit pada ulangan 1 dan 11.8 menit pada ulangan 2 dan peptida berberat molekul 356.0 dengan waktu retensi 15.7 dan 15.0 menit secara berurutan untuk ulangan 1 dan 2. Walaupun kedua peptida tersebut mempunyai berat molekul yang sama, tetapi kandungan asam aminonya berbeda. Pada peptida yang terelusi pada waktu 11.8 dan 12.0 menit mengandung asam amnio LysGln yang ditandai adanya peak dengan mz 146.9 [LysGln+H] + dan 129.9 [LysGln+H-NH 3 ] + Lampiran 11 dan 12. Asam amino Lys dan Gln sulit dibedakan karena mempunyai berat molekul yang sama, akan tetapi peptida ini diduga mengandung asam amino Lys yang Gambar 8 Kromatogram Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 1 ikan asin jambal roti goreng 23.5 mgml menggunakan kolom C8, elusi gradien 2 ACN yang mengandung 0.1 asam format hingga 50 ACN yang mengandung 0.1 asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 mlmenit. Gambar 9 Kromatogram Fraksi A hasil fraksinasi Fraksi 1 ulangan 2 ikan asin jambal roti goreng 7.8 mgml menggunakan kolom C8, elusi gradien 2 ACN yang mengandung 0.1 asam format hingga 50 ACN yang mengandung 0.1 asam format selama 50 menit, flow rate 0.1 mlmenit. . Tabel 6 Berat molekul senyawa dan dugaan kandungan asam amino yang ada pada Fraksi A Fraksi 1 ekstrak ikan asin jambal roti ulangan 1 dan 2 Ulangan 1 Ulangan 2 No. peak Massa MS1 Waktu Retensi menit Dugaan kandungan asam amino No. peak Massa MS1 Waktu Retensi menit Dugaan kandungan asam amino 1. 314.0 11.4 LysGln 1. 356.2 11.8 LysGln 2. 356.1 12.0 LysGln 2. 262.0 12.2 Val, LeuILe 3. 323.0 12.6 - 3. 376.0 13.0 - 4. 326.0 13.2 Val b,c 4. 227.9 13.6 Val, Trp 5. 430.1 14.0 Val,Trp 5. 393.0 14.0 Val, Pro 6. 451.9 14.6 - 6. 423.1 14.4 Met 7. 356.0 15.7 Met, Pro 7. 355.9 15.0 Met 8. 444.1 17.1 Glu, 2 Asp 8. 243.9 15.5 Met 9. 431.1 17.6 Pro, LeuIle, LysArg 9. 408.1 16.2 LysGln 10. 260.0 18.4 LeuIle 10. 246.0 16.8 Tyr 11. 389.0 19.0 LeuIle 11. 375.1 17.2 Gly, Glu, Pro, LysGln 12. 431.1 20.1 LeuIle 12. 259.9 17.5 LeuIle,Val 13. 424.0 25.8 LeuIle,Met 13. 431.1 18.4 LeuIle 14. 457.1 27.7 LeuIle 14. 130.9 22.5 LeuIle 15. 424.1 29.0 LeuIle, Asn 15. 389.0 29.3 LeuIle,Val 16. 430.2 31.2 Asp, LeuIle 16. 346.0 34.8 LeuIle 17. 439.2 31.9 LeuIle, 2 Val, Pro 17. 246.0 43.1 LeuIle, Asp 18. 474.2 32.4 2 LeuIle 18. 375.0 44.6 LeuIle, Val 19. 474.1 32.8 LeuIle 20. 389.0 33.7 LeuIle 21. 474.2 36.4 2 LeuIle, Pro 22. 368.0 41.2 LeuIle, Asp 23. 476.1 44.4 LeuIle, Val 24. 446.1 46.0 Pro, LeuIle 25. 472.1 47.0 LeuIle, Asp, Glu 26. 389.1 47.9 LeuIle, Asp, Pro didasarkan penelitian Petritis et al. 2002 bahwa dipeptida yang mengandung Lys memberikan ion molekul dengan mz 147.0 dan 129.0, sedangkan dipeptida yang mengandung Gln hanya menghasilkan ion molekul dengan mz 147. Selain itu, peptida-peptida yang dihasilkan dari pemecahan protein ikan asin jambal roti diduga merupakan hasil pemecahan enzim tripsin yang mempunyai spesifikasi memotong protein dari residu asam amino Arginin Arg atau Lisin Lys Covey et al., 1991. Sedangkan peptida dengan waktu retensi lebih banyak menunjukkan mengandung asam amino Met yang ditandai adanya peak dengan mz 149.8 [Met+H] + , 132.8 [Met+H-NH 3 ] + dan 103.9 yang merupakan ion immonium dari Met Lampiran 11 dan 12. Pada ulangan 1, keberadaan Glu hanya terdeteksi pada 2 peptida yaitu peptida dengan BM 444.1 17.1 menit dan 472.1 47.0 menit. Selain Glu, pada kedua peptida ini juga terdeteksi adanya Asp, sehingga peptida ini diduga mempunyai rasa gurih. Sedangkan pada ulangan 2, terdapat 1 peptida yang mengandung Glu yaitu peptida dengan berat molekul 375.1 17.2 menit. Pada peptida ini, tidak terdeteksi adanya Asp akan tetapi terdeteksi adanya Gly yang diketahui berperan penting bersamaan dengan Lys terhadap pembentukan rasa gurih oktapeptida BMP dari kaldu daging sapi Yamasaki dan Maekawa 1980 di dalam Nishimura dan Kato 1988. Asam amino Lys sulit dibedakan dengan Gln karena merupakan isomernya. Akan tetapi, penelitian dari Petritis et al. 2002 menunjukkan dipeptida yang mengandung Lys dapat dibedakan dengan dipeptida yang mengandung Gln yaitu adanya ion dengan mz 129 yang dihasilkan dipeptida yang mengandung Lys tetapi tidak oleh peptida yang mengandung Gln. Adapun peptida yang ada pada fraksi ini menghasilkan ion dengan m.z 129 Lampiran 11 dan 12 sehingga diduga asam amino yang ada pada peptida ini adalah Lys. Berdasarkan hal tersebut, diduga peptida ini berpotensi mempunyai rasa gurih.

c. Fraksi B