4 C selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dibagi menjadi dua bagian,
yaitu untuk dinetralkan dan tidak dinetralkan masing-masing sebanyak 10 ml. Kemudian kedua bagian supernatan tersebut disaring dengan menggunakan
membran filter 0.22 µ
m.
Pengujian senyawa antimikroba dilakukan dengan metode uji kontak dengan menggunakan bakteri uji Listeria monocytogenes. Sebanyak 10 ml
supernatan yang dinetralkan dan tidak dinetralkan diinokulasikan dengan ±10
5
bakteri uji Listeria monocytogenes dan diinkubasi selama 8 jam pada suhu 37
C. Jumlah koloni Listeria monocytogenes dihitung pada jam ke-0 dan jam ke-8 inkubasi. Perhitungan jumlah koloni dilakukan berdasarkan
SPC Standard Plate Count dan dapat dilihat pada Lampiran 3. Apabila ada penghambatan terhadap Listeria monocytogenes, diduga
ada senyawa antimikroba yang dihasilkan selain asam, yaitu bakteriosin.
b. Penentuan Kurva Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat Rattanachaikunsopon
dan Phumkhachorn, 2006
Isolat BAL yang menunjukkan aktivitas bakteriosin diinokulasikan ke dalam MRSB sebanyak 2 . Kemudian dibaca nilai absorbansi atau OD Optical Density
dengan menggunakan spektofotometer UV visible setiap 1 atau 2 jam sekali sampai nilai absorbansi konstan yang menunjukkan pertumbuhan BAL telah mencapai fase
stasioner. Apabila pembacaan absorbansi di spektrofotometer menunjukkan nilai di atas 1, MRSB isolat BAL diencerkan dengan menggunakan MRSB steril dengan
faktor pengenceran tertentu. Perhitungan nilai OD dapat dilihat pada Lampiran 4.
c. Konfirmasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Bakteriosin
Pada tahap ini BAL diinkubasi sampai fase akhir eksponensial dan digunakan supernatan yang dinetralkan dengan NaOH untuk mengeliminasi
kemungkinan penghambatan oleh asam. Isolat BAL yang menunjukkan aktivitas penghambatan yang tinggi pada metode kontak diujikan sifat
penghambatannya terhadap Listeria monocytogenes dengan metode sumur. Selain itu dilakukan juga uji penghambatan dengan metode kontak.
Pada metode sumur digunakan bakteri uji Gram positif, yaitu Listeria monocytogenes, Bacillus cereus,
dan Staphylococcus aureus. Kultur BAL diinokulasikan pada media MRSB dan diinkubasi pada suhu 37
o
C sampai akhir fase eksponensial. Selanjutnya kultur disentrifugasi pada 8000 rpm
4 C selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dinetralkan sampai pH 6.5
menggunakan NaOH 1 N. Kemudian supernatan yang dinetralkan dan tidak dinetralkan disaring dengan menggunakan membran filter 0.22
µ m. Kultur
bakteri uji yang telah disegarkan diinokulasikan sebanyak ±10
6
bakteri ke dalam media NA. Selanjutnya 20 ml media agar NA yang telah terisi kultur
uji dituangkan ke cawan dan dibiarkan menjadi padat. Setelah memadat, dibuat sumur-sumur dengan diameter 6 mm, kemudian dimasukkan 60
µ l
kultur BAL yang telah diinkubasi dalam MRSB sampai fase stasioner. Sumur ini kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari. Zona penghambatan adalah lebar areal bening yang terbentuk di sekitar sumur yang dinyatakan
dengan satuan mm. Cara perhitungan diameter penghambatan dapat dilihat pada Lampiran 2.
Pada metode kontak digunakan bakteri uji Listeria monocytogenes. Kultur BAL diinokulasikan pada media MRSB dan diinkubasi pada suhu 37
o
C sampai akhir fase eksponensial. Selanjutnya kultur disentrifugasi pada 8000 rpm 4
C selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dinetralkan sampai pH 6.5 menggunakan NaOH 1 N. Kemudian supernatan yang
dinetralkan dan tidak dinetralkan disaring dengan menggunakan membran filter 0.22
µ m. Sebanyak 10 ml supernatan yang dinetralkan diinokulasikan
dengan ±10
5
bakteri uji Listeria monocytogenes dan diinkubasi selama 8 jam pada suhu 37
C. Jumlah koloni Listeria monocytogenes dihitung pada jam ke-0 dan jam ke-8 inkubasi. Perhitungan jumlah koloni dilakukan
berdasarkan standar SPC Standard Plate Count dan dapat dilihat pada Lampiran 3.
d. Ekstraksi Bakteriosin dan Uji Penghambatannya Terhadap Bakteri Patogen
