Pengendalian Biofilm Edwardsiella tarda Pada Permukaan Sisik Ikan dan Plastik PVC dengan Senyawa Antimikroba yang Dihasilkan oleh Bakteri Asam Laktat (BAL)

i

PENGENDALIAN BIOFILM

Edwardsiella tarda

PADA

PERMUKAAN SISIK IKAN DAN PLASTIK PVC DENGAN

SENYAWA ANTIMIKROBA YANG DIHASILKAN OLEH

BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)

SKRIPSI

TIEN PRATIWI SITINJAK 100805048

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2015

ii

PENGENDALIAN BIOFILM

Edwardsiella tarda

PADA

PERMUKAAN SISIK IKAN DAN PLASTIK PVC DENGAN

SENYAWA ANTIMIKROBA YANG DIHASILKAN OLEH

BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains

TIEN PRATIWI SITINJAK 100805048

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2015

PERSETUJUAN

Judul : Pengendalian BiofilmEdwardsiella tardaPada Permukaan Sisik Ikan dan Plastik PVC dengan Senyawa Antimikroba yang Dihasilkan oleh Bakteri Asam Laktat (BAL)

Kategori : Skripsi

Nama : Tien Pratiwi Sitinjak

Nomor Induk Mahasiswa : 100805048

Program Studi : Sarjana (S1) Biologi

Departemen : Biologi

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara

Disetujui di Medan, Mei 2015

Komisi Pembimbing : Pembimbing 2,

Dra. Nunuk Priyani, M. Sc NIP: 196404281996032001

Pembimbing 1,

Dr. It Jamilah, M.Sc

NIP: 196310121991031001

Disetujui oleh

Departemen Biologi FMIPA USU Ketua,

Dr. Nursahara Pasaribu, M. Sc NIP. 1963012319900320

PERNYATAAN

PENGENDALIAN BIOFILMEdwardsiella tardaPADA PERMUKAAN SISIK IKAN DAN PLASTIK PVC DENGAN SENYAWA ANTIMIKROBA

YANG DIHASILKAN OLEH BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil karya sendiri. Kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, Mei 2015

Tien Pratiwi Sitinjak 100805048

PENGHARGAAN

Puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa yang telah memberikan kasihNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan judulPengendalian BiofilmEdwardsiella tardapada Permukaan Sisik Ikan dan Plastik PVC dengan Senyawa Antimikroba yang dihasilkan oleh Bakteri Asam Laktat (BAL)

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada Ibu Dr. It Jamilah, M. Sc selaku Dosen Pembimbing I dan Ibu Dra. Nunuk Priyani, M.Sc selaku Dosen Pembimbing II yang telah memberikan nasehat dan bimbingan kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini. Terimakasih kepada Bapak Prof. Dr. Dwi Suryanto, M. Sc selaku Dosen Penguji I dan Ibu Dr. Hesty Wahyuningsih M.Si selaku Dosen Penguji II yang telah memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penyusunan skripsi ini. Terimakasih kepada Ibu Dr. Nursahara Pasaribu, M.Sc selaku Ketua Departemen Biologi FMIPA USU, Bapak Dr. Sutarman, M. Sc selaku Dekan FMIPA USU, Ibu Dr. Marpongahtun, M. Sc selaku Pembantu Dekan I, Bapak Drs. Nursal, M.Sc selaku Pembantu Dekan II dan Bapak Drs. Kerista Sebayang, M. Si selaku Pembantu Dekan III, Bapak dan Ibu Dosen Biologi FMIPA USU, kepada Bang Erwin dan Ibu Roslina Ginting serta seluruh staf pegawai FMIPA USU, terimakasih saya ucapkan atas semua bantuannya.

Terimakasih tak terhingga kepada kedua orangtuaku tercinta, Bapak St. Aden Sitinjak dan Ibu Nurtiana Simamora yang senantiasa berkorban, mencintai dan berdoa untukku, juga kepada kakak ku tersayang, Eva Helen Sitinjak, SE dan adik-adikku tercinta Dickwanda Lestari, Lily, Sonia Togi, Johannes Risky, Aber Tulusyang memberikan dukungan penuh dan juga mendoakanku dalam menyelesaikan skripsi ini.

Kepada sahabat-sahabat terbaikku Evalentina Sinaga, Netty Gurning S.Si, Sunarty Sinaga S.Si danJesika Sembiring Amd, terimakasih untuk setiap penghiburan dan dukungannya, dan terkhusus kepada kekasihku Pranatal Manullang S.Pd terimakasih atas kasih sayang tak terhingga, motivasi dan doa yang diberikan dalam penyelesaian skripsi ini.

Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada teman seperjuangan dalam melakukan penelitian di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran USU, Nialusi Hutagaol, Norton Adiyanto Pane, Yuli Evalintina Gultom, Mailani Quanti, Farah Dwi, Nurul Alfitanisa, Devi Permatasari, Ledi Benneta, Arance Yoane dan kak Hilwa, atas semangat yang tak pernah padam dalam melakukan penelitian dan menyelesaikan skripsi ini. Juga kepada seluruh teman-teman Biologi Revolution yang tidak dapat disebutkan satu persatu terkhusus Jwita sihombing, Silvia Julita, Riris Delima, Hendika, Tiur, Posma, Tonisman, Dian Lestari dan senior terbaik Bang Adrian Hartanto dan Bang Imam Aulia, serta seluruh adik-adik stambuk 2011-2014 Biologi FMIPA USU

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, untuk itu dengan lapang dada penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak demi kesempurnaan skripsi ini. Atas partisipasi dan dukungannya penulis ucapkan terimakasih.

PENGENDALIAN BIOFILMEdwardsiella tardaPADA PERMUKAAN SISIK IKAN DAN PLASTIK PVC DENGAN SENYAWA ANTIMIKROBA YANG DIHASILKAN OLEH BAKTERI ASAM LAKTAT

(BAL)

ABSTRAK

Eswardsiella tarda merupakan bakteri penyebab edwardsielosis pada ikan dan mampu membentuk biofilm pada permukaan padat. Penelitian ini bertujuan untuk mengendalikan biofilm E. tarda dengan memanfaatkan ekstrak kasar senyawa antimikroba bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan gurame. Dari 14 isolat hasil isolasi pada media MRSA didapatkan isolat PG7 yang paling potensial dalam menghambat E. tarda dengan diameter zona hambat 8,15 mm. Ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL PG7 digunakan untuk mengendalikan biofilmE. tardayang dibentuk pada hari ke 1, 3, 5 di dalam media NB pada permukaan sisik ikan gurame dan plastik PVC, kemudian dilakukan pelepasan sel biofilm dengan serbuk kaca halus(glass bead)dengan metode TPC. BiofilmE. tardamampu membentuk biofilm dengan jumlah sel tertinggi pada hari ke-3 yaitu sebesar 1012 CFU/lempeng baik pada permukaan lempeng sisik ikan maupun plastik PVC. Ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL PG7 mampu menurunkan jumlah sel biofilm pada masing-masing uji sebesar 18%. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa biofilmE. tardasulit untuk dikendalikan dan ekstrak kasar senyawa anti mikroba BAL PG7 dapat menghambat sel biofilm E. tardasebesar 18%.

Kata kunci: Bakteri asam laktat,Edwardsiella tarda,biofilm, sisik ikan, dan plastik PVC

CONTROL OFEdwardsiella tardaBIOFILM ON SCALES OF FISH AND PVC PLASTIC SURFACE WITH ANTIBACTERIAL COMPOUNDS OF

LACTID ACID BACTERIA (LAB)

ABSTRACT

Edwardsiella tarda is a bacterium that causes edwardsielosis on fish and able to form biofilm on solid surface. The aim of this research was to control E. Tarda biofilm using antibacterial compound of lactid acid bacteria (LAB) isolated from Osphronemous gouramy. There were 14 LAB isolates, among them PG7 was found as a potential biocontrol agent which showed the highest inhibition (8.15 mm) compare to others. PG7 was used to produce antibacterial compound to control biofilm cells of E. Tarda which was performed in 1, 3, 5 days in nutrition broth medium on fish scale and Polyvinyl cloride then were detached using micro glass bead for counting by TPC. The highest number of biofilm cells were found at 3 days incubation as much 1012CFU/chip. Controlling biofilm cell of E. tardawith crude extract of antibacterial compound of LAB PG7 isolate reduced 18% biofilm cell ofE. tarda. It was concluded that biofilmE. tardadifficult to control and crude extract can inhibit biofilm cells ofE. tardaby 18%.

DAFTAR ISI Halaman Persetujuan Pernyataan Penghargaan Abstrak Abstract Daftar Isi Daftar Tabel Daftar Gambar Daftar Lampiran i ii iii iv v vi viii ix x

BAB 1 Pendahuluan 1

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Permasalahan 3

1.3 Tujuan Penelitian 3

1.4 Manfaat 3

BAB 2 Tinjauan Pustaka 4

2.1 Ikan Gurame(Osphrenomus gouramy) 4

2.2 BakteriEdwardsiella tarda 5

2.3 Biofilm 6

2.4 BAL (Bakteri Asam Laktat) 7

BAB 3 Bahan Dan Metode 9

3.1 Waktu dan Tempat 9

3.2 Alat dan Bahan 3.3 Rancangan Percobaan 3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Isolasi dan Karakterisasi Awal Bakteri Asam Laktat

9 9 10 10 3.4.2 Seleksi BAL PotensialterhadapE. tarda

3.4.3 Kurva Pertumbuhan Isolat BAL 3.4.4 Produksi Senyawa Antimikroba BAL

3.4.5 Uji Aktivitas Senyawa Antimikroba terhadapE. tarda 3.4.6 Pembentukan dan Penghitungan Sel BiofilmE. tarda 3.4.7 Pengendalian sel biofilmE. tarda

BAB 4 Hasil dan Pembahasan 4.1 Isolasi Bakteri Asam Laktat

4.2 Uji daya hambat BAL terhadap pertumbuhan bakteriE. tarda

11 11 11 12 12 13 14 14 16

4.3 Fase pertumbuhan BAL

4.4 Uji antagonis senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL terhadap E. Tarda

4.5 Pembentukan dan pengendalian BiofilmE. tarda BAB 5 Kesimpulan dan Saran

18 19 21 25

Daftar Pustaka Lampiran

26 31

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

4.1. Karakteristik morfologi dan Biokimia Isolat BAL 15 4.2. Diameter zona hambat BAL terhadapE. Tarda

pada konsentrasi sel 108CFU/mL

16 4.3.

4.4.

Diameter zona hambat senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL PG 7 dan US7 terhadap E. Tarda

Pembentukan dan penurunan rata-rata Jumlah Sel Biofilm Edwardsiella tarda pada Sisik Ikan dan Plastik PVC sebelum dan setelah kontak 1 jam dengan senyawa antimikrobaekstrak kasar BAL PG 7

20 23

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

4.1. Diameter zona hambat isolat BAL potensial 17

4.2. Kurva pertumbuhan isolat BAL SPG 7 dan US7 pada medianutrient broth, suhu 280_{C selama 30}

jam

18 4.3. Diameter zona hambat ekstrak kasar senyawa

antimokroba BAL terhadap pertumbuhan bakteri patogen

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

1. Isolasi Bakteri Asam Laktat 31

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Alur Kerja Karakterisasi BAL

Seleksi BAL Potensial dalam

MenghambatPertumbuhanEdwardsiella tarda Kurva Pertumbuhan BAL

Produksi Senyawa Antimikroba BAL

Uji Aktivitas Senyawa Antimikroba Ekstrak Kasar B menghambat pertumbuhan bakteri

Edwardsiella tarda

Pembentukan sel BiofilmEdwardsiella tardaPada lempe PVC

Foto Penelitian

32 33 34 34 35 36 37

PENGENDALIAN BIOFILMEdwardsiella tardaPADA PERMUKAAN SISIK IKAN DAN PLASTIK PVC DENGAN SENYAWA ANTIMIKROBA YANG DIHASILKAN OLEH BAKTERI ASAM LAKTAT

(BAL)

ABSTRAK

Eswardsiella tarda merupakan bakteri penyebab edwardsielosis pada ikan dan mampu membentuk biofilm pada permukaan padat. Penelitian ini bertujuan untuk mengendalikan biofilm E. tarda dengan memanfaatkan ekstrak kasar senyawa antimikroba bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan gurame. Dari 14 isolat hasil isolasi pada media MRSA didapatkan isolat PG7 yang paling potensial dalam menghambat E. tarda dengan diameter zona hambat 8,15 mm. Ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL PG7 digunakan untuk mengendalikan biofilmE. tardayang dibentuk pada hari ke 1, 3, 5 di dalam media NB pada permukaan sisik ikan gurame dan plastik PVC, kemudian dilakukan pelepasan sel biofilm dengan serbuk kaca halus(glass bead)dengan metode TPC. BiofilmE. tardamampu membentuk biofilm dengan jumlah sel tertinggi pada hari ke-3 yaitu sebesar 1012 CFU/lempeng baik pada permukaan lempeng sisik ikan maupun plastik PVC. Ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL PG7 mampu menurunkan jumlah sel biofilm pada masing-masing uji sebesar 18%. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa biofilmE. tardasulit untuk dikendalikan dan ekstrak kasar senyawa anti mikroba BAL PG7 dapat menghambat sel biofilm E. tardasebesar 18%.

Kata kunci: Bakteri asam laktat,Edwardsiella tarda,biofilm, sisik ikan, dan plastik PVC

CONTROL OFEdwardsiella tardaBIOFILM ON SCALES OF FISH AND PVC PLASTIC SURFACE WITH ANTIBACTERIAL COMPOUNDS OF

LACTID ACID BACTERIA (LAB)

ABSTRACT

Edwardsiella tarda is a bacterium that causes edwardsielosis on fish and able to form biofilm on solid surface. The aim of this research was to control E. Tarda biofilm using antibacterial compound of lactid acid bacteria (LAB) isolated from Osphronemous gouramy. There were 14 LAB isolates, among them PG7 was found as a potential biocontrol agent which showed the highest inhibition (8.15 mm) compare to others. PG7 was used to produce antibacterial compound to control biofilm cells of E. Tarda which was performed in 1, 3, 5 days in nutrition broth medium on fish scale and Polyvinyl cloride then were detached using micro glass bead for counting by TPC. The highest number of biofilm cells were found at 3 days incubation as much 1012CFU/chip. Controlling biofilm cell of E. tardawith crude extract of antibacterial compound of LAB PG7 isolate reduced 18% biofilm cell ofE. tarda. It was concluded that biofilmE. tardadifficult to control and crude extract can inhibit biofilm cells ofE. tardaby 18%.

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sektor kelautan dan perikanan merupakan salah satu sumber andalan dalam pembangunan perikanan di Indonesia. Produksi dari perikanan budi daya sendiri secara keseluruhan diproyeksikan meningkat dengan rata-rata 4,9% per tahun. Target tersebut antara lain didasarkan atas potensi pengembangan daerah perikanan budi daya yang memungkinkan di wilayah Indonesia. Besarnya potensi pengembangan perikanan budi daya serta didukung peluang pasar internasional yang masih terbuka luas, maka diharapkan sumbangan produksi perikanan budi daya semakin besar terhadap produksi nasional dan penerimaan devisa negara (Sukadi, 2004).

Usaha mencapai target produksi sesuai dengan yang diharapkan, diiringi berbagai permasalahan seperti kegagalan produksi akibat serangan bakteri. Salah satu bakteri penyebab penyakit utama pada ikan ialah Edwardsiella tarda yang menyebabkan penyakit yang dikenal dengan namaEdwardsillosis atau Emphysematous putrefactive disease (EPD). Penyakit ini sudah menyerang 25 negara di Amerika utara, Amerika serikat, Eropa, Australia, Asia, dan Afrika (Hawke, 2003). Berdasarkan pemantauan hama dan penyakit ikan karantina pada tahun 2005, Edwardsiella tarda telah ditemukan di pulau Jawa, Sumatera, dan Kalimantan (Firma et al. 2012). Selain E. tarda, beberapa bakteri patogen juga menyebabkan penyakit pada ikan seperti Streptococcus agalactiae yang menyebabkan penyakit streptococcosis (Taukhid, 2009),Mycobacterium fortuitum menyebabkan penyakit mycobacteriosis (Irianto, 2005), Pseudomonas sp. (Djauhari, 2006), Aeromonas hydrophila,Aeromonas salmonicida,dan Vibriosp. (Hatmantiet al.2009).

Ikan yang terserang penyakit Edwardsillosis tidak menunjukkan gejala klinis yang tersirat, hanya anoreksia yang bersifat umum. Gejala lain yaitu pendarahan pada kulit, kehilangan warna tubuh dan terjadi luka yang merata pada

seluruh permukaan tubuh (Ratnawatiet al.2013). Kurang lebih 250 kasus penyakit yang disebabkan oleh Edwardsiella tarda telah dilaporkan menimbulkan gastroenteritis, septicemia, dan infeksi pada jaringan lunak (Janda and Abbort, 1993).

Menurut Flemming (2008), bakteri patogen di perairan terbagi dalam dua bentuk kehidupan yaitu planktonik yang merupakan sel bebas yang melayang di perairan dan biofilm yang merupakan sel yang menempel di permukaan padat dan membentuk lapisan semi solid. Sel biofilm lebih tahan dibandingkan dengan sel planktonik terhadap bahan-bahan antimikroba maupun kondisi fisik yang ekstrim (Marshall, 1995). Oleh sebab itu, apabila bakteri patogen membentuk sel biofilm dan mengkontaminasi areal perikanan maka kemungkinan besar ikan-ikan akan terserang penyakit bahkan mengalami kematian.

Keberadaan bakteri patogen seperti Edwardsiella tarda pada ikan jelas sangat merugikan petani dan nelayan ikan saat ini, sehingga dibutuhkan agen biologis yang dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen pada ikan. Menurut Pradana et al. (2009), penggunaan antibiotik seringkali tidak efektif dan dalam kurun waktu yang lama dapat menimbulkan residu pada ikan dan petani ikan. Penggunaan probiotik yang bekerja melalui mekanisme tertentu untuk melawan patogen, dipandang sebagai langkah alternatif.

Probiotik memanfaatkan sifat antagonis terhadap mikroorganisme lain dengan menghasilkan senyawa antibakteri. Salah satu bakteri probiotik yang sangat efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen saat ini adalah BAL (Bakteri Asam Laktat). BAL merupakan salah satu agen probiotik yang dapat mengendalikan pertumbuhan bakteri dan jamur patogen. Pada penelitian sebelumnya telah ditemukan BAL yang mampu mengendalikan pertumbuhan bakteri patogen pada ikan, diantara nyaLactobacillus agilis yang potensial dalam menghambat patogen Mycobacterium fortuitum pada ikan (Sitepu et al., 2013), Lactobacillus acidophilus potensial menghambat bakteri Aeromonas hydrophila (Harahap et al., 2013), Lactobacillus plantarum potensial dalam menghambat petumbuhan bakteri Streptococcus agalactiae (Mayasari et al., 2013), Lactobacillus fructivorans potensial dalam menghambat Vibrio anguillarum (Carnevaliet al., 2004).

1.2Permasalahan

1. Apakah ditemukan isolat BAL yang potensial dalam menghambat pertumbuhanE. tarda

2. Apakah isolatE. tardamampu membentuk biofilm pada permukaan sisik ikan dan plastik PVC

3. Apakah ekstrak kasar senyawa antibakteri BAL yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan gurame mampu mengendalikan biofilmE. tarda

1.2 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini ialah

1. isolasi dan karakterisasi BAL dari ikan gurame

2. seleksi BAL yang potensial dalam menghambat pertumbuhan bakteriE. tarda yang bersifat patogen pada ikan air tawar

3. mengetahui kemampuanE. tardadalam membentuk biofilm pada permukaan sisik ikan dan plastic PVC

4. uji kemampuan ekstrak kasar senyawa anti mikroba BAL terpilih dalam mengendalikan biofilmE. tarda

1.3 Manfaat Penelitian

Mendapatkan isolat BAL dari usus ikan gurame yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri seperti E. tarda sehingga dapat digunakan sebagai calon agen pengendalian hayati terhadap bakteriE. tarda. Dengan demikian dapat memberikan kontribusi untuk pengendalian penyakit pada budi daya ikan khususnya terhadap bakteriE. tarda.

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Ikan Gurame (Osphronemous gouramy)

Berdasarkan kebiasaan makanannya, ikan gurame (Osphronemous gouramy) adalah ikan omnivora yang bertendensi herbivora. Oleh karena itu, di alam ikan gurame dapat mengkonsumsi sumber pakan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan. Disamping itu untuk memenuhi kebutuhan proteinnya ikan gurame juga dapat memanfaatkan detritus yang berasal dari dasar perairan. Detritus banyak mengadung jasad renik dan mikroorganisme yang ikut berperan dalam menyumbangkan enzim pencernaan eksogen untuk mendegradasi nutrien pakan yang dikonsumsi oleh ikan. Jasad renik dan mikroorganisme tersebut juga merupakan sumber nutrien tambahan bagi ikan. Mikroflora adalah mikroorganisme yang secara alamiah menghuni saluran pencernaan makhluk hidup. Mikroflora terdiri atas berbagai mikrob dalam jumlah besar, dengan aktivitas dan kapasitas metabolik yang sangat beragam, serta yang dapat memberi pengaruh positif maupun negatif pada fungsi fisiologis saluran pencernaan (Alamsyahet al., 2009). Oleh karena itu dapat dipastikan bahwa pada saluran pencernaan ikan gurame terdapat probiotik seperti BAL.

Gurame (Osphronemous gouramy) merupakan jenis ikan konsumsi air tawar yang secara fisik dikenali dari bentuk badan yang pipih lebar, bagian punggung berwarna merah sawo dan bagian perut berwarna kekuningan/keperakan. Ikan gurame merupakan keluarga Anabantidae, keturunan Helostoma dan ordo Labyrinthici. Ikan gurame berasal dari perairan daerah Sunda (Jawa Barat, Indonesia), dan menyebar ke Negara Malaysia, Thailand, dan Australia. Pertumbuhan ikan gurame agak lambat dibanding ikan air tawar jenis lain (Anonim, 2006). Ikan gurame merupakan salah satu ikan air tawar yang bernilai ekonomis tinggi di Indonesia khususnya di Jawa Barat. Ikan gurame(Osphronemus gouramy) merupakan salah satu diantara ikan tawar yang memiliki kandungan gizi yang tinggi. Keunggulan ikan gurame disbanding ikan tawar lainnya selain rasa dan

kandungan gizinya tinggi, ikan gurame mudah dipelihara karena bersifat pemakan apa saja, dapat berkembang biak secara alami, dan dapat hidup di air tergenang, serta harganya relativ mahal (Jangkaru 2002 dalam Sudirja, 2007).

Ikan gurame Osphronemous gouramy sebagai komoditas ikan air tawar memiliki alat pernapasan tambahan berupa labirin yang mulai terbentuk pada umur 18–24 hari sehingga dapat bertahan hidup pada perairan yang kurang oksigen karena mampu mengambil oksigen dari udara bebas (Standar Nasional Indonesia (SNI): 01-6485.2-2000).

2.2 BakteriEdwardsiella tarda

Bakteri E. tarda merupakan bakteri Gram-negatif yang berbentuk batang bengkok, dengan ukuran 1 x 2-3 µm, bersifat Gram negatif bergerak dengan bantuan flagella, tidak membentuk spora atau kapsul dan bersifat fakultatif anaerob. Bakteri ini dapat dijumpai di lingkungan air tawar dan air laut, dengan suhu optimal bagi pertumbuhannya sekitar 35 o_{C, sedangkan pada suhu dibawah 10} o_{C atau}

diatas 45 o_{C tidak dapat tumbuh (Mohanty and Sahoo, 2007). Lesi patologis}

anatomisE. tardaadalah warna tubuh pucat, dan apabila ikan terserang bakteri ini akan tampak pendarahan organ visceral, infeksi ringan yang ditandai dengan luka kecil, sementara jika infeksi akut luka akan bernanah berisi gas dan berbau busuk (Firmaet al.2012).

Bakteri E. tarda tidak memproduksi endotoksin seperti pada umumnya bakteri Gram negatif, tetapi menghasilkan dua eksotoksin yang dapat menyebabkan lesi. E. tarda merupakan tipe bakterium enterik dan dapat bertahan didalam air dan lumpur sehingga air dan lumpur yang sudah bebas dari ikan yang sakit dapat menjadi karier dan menyebabkan timbulnya kembali penyakit.E. tarda telah diisolasi 75% dari sampel air kolam, 64% pada sampel lumpur kolam, dan 100% dari kodok, kura-kura dan ikan kolam. Hal ini menunjukkan bahwaE. tarda merupakan mikroflora pada kolam ikan dan adanya bakteri tersebut membuat potensi penyakit ikan tetap ada (Narwiyani, 2010).

Edwardsilosis merupakan salah satu penyakit yang sangat banyak menyerang ikan. Penyakit ini sudah diteliti sejak 40 tahun yang lalu dan terjadi karena interaksi antara bakteri E. tarda dengan host dan lingkungan, juga

kemampuannya hidup sebagai sel planktonik dan sel biofilm (Mohanty and Sahoo, 2007). Pada penelitian sebelumnyaE. tarda dapat dikendalikan dengan antibiotik seperti aminoglycosides, cephalosporins, penicillins, imipenem, aztreonam, ciprofloxacin, sulphamethoxazole, nitrofurantoin dan antibiotik betalactamase-inhibitor agents(Clarket al., 1991).

2.3 Biofilm

Biofilm merupakan kumpulan dari sel-sel mikrobial yang melekat pada secara ireversibel pada suatu permukaan dan terbungkus dalam matriks Extracellular polymeric Subtances (EPS) yang dihasilkannya sendiri serta memperlihatkan adanya perubahan fenotip seperti perubahan tingkat pertumbuhan dan perubahan transkripsi gen dari sel planktonik atau sel bebasnya. EPS berfungsi sebagai penghubung antar permukaan sel dan menjadi inisiasi pada pembentukan biofilm. Faktor-faktor yang mempengaruhi perlekatan sel-sel bakteri dalam pembentukan biofilm adalah efek substratum (permukaan tempat melekatnya), conditioning film, hidrodinamik dari aliran yang melewatinya, karakteristik media cairan, dan keadaan permukaan sel bakteri yang melekat (Gunardi, 2010).

Pembentukan biofilm terjadi secara terstruktur pada permukaan padatan sehingga membentuk lapisan tipis (Prakas, 2003) melalui 3 tahapan proses, yaitu tahap pelekatan bakteri pada permukaan padatan (attachment),kolonisasi, dan tahap pertumbuhan biofilm bakteri (Prakash et al. 2003). Pada tahap pelekatan, bakteri mendekati permukaan melalui gaya elektrostatik maupun gaya fisika. Pada umumnya, ketersediaan nutrisi, suhu air dan laju alir cairan yang memadai serta karakteristik bakteri seperti adanya flagela dan permukaan sel yang terasosiasi dengan poplisakarida atau protein mempercepat proses pelekatan. Setelah itu bakteri berasosiasi satu sama lainnya membentuk mikrokoloni (Sastrawidana dan Sukarta, 2013).

Terbentuknya biofilm adalah sebagai strategi bagi mikroorganisme untuk mempertahankan populasinya karena adanya EPS yang mencegah difusi senyawa-senyawa toksik yang membahayakan serta mengatur pertumbuhan sel (Qureshiet al. 2005). Jika mikroba dapat membentuk biofilm pada proses pertumbuhannya,

daya tahan terhadap kondisikondisi buruk lebih tinggi jika dibandingkan dengan pertumbuhannya sebagai sel planktonik, oleh sebab itu sel biofilm merupakan sumber kontaminan yang sangat besar terhadap produk pangan (Donlan 2002).

Edwardsiella tarda merupakan bakteri yang mampu membentuk biofilm pada permukaan padat. Kemampuannya tersebut membuat bakteri ini menjadi bakteri yang sangat patogen terhadap manusia maupun hewan terkhusus ikan. Pada areal perairan, E. tardamampu membentuk biofilm pada semua permukaan padat termasuk sisik ikan, hal tersebut membuat bakteri E. tarda menjadi salah satu bakteri utama penyebab penyakit pada ikan (Zhanget al., 2008).

2.4 BAL (Bakteri Asam Laktat)

Bakteri Asam Laktat didefenisikan sebagai kelompok bakteri Gram positif, tidak membentuk spora, berbentuk batang atau bulat, katalase dan oksidase negatif serta bersifat aerotoleran anaerob. Kemampuan menggunakan karbohidrat sebagai sumber energi, serta produksi asam laktat sebagai produk tunggal atau produk utama merupakan penciri metabolismenya (Wirawati, 2002). Bakteri asam laktat sering ditemukan secara alamiah dalam bahan pangan. Bakteri ini hidup pasa susu, daging segar, dan sayur-sayuran dalam jumlah yang kecil. Dalam proses fermentasi spontan, bakteri asam laktat sering ditemukan sebagai mikroflora yang dominan dalam menghambat bakteri perusak dan patogen (Situngkir, 2005).

Perkembangan klasifikasi BAL yang terbaru menurut Salminen dan Wright (1998), terdiri atas 16 genera yaitu Aerococcus, Alloiococcus, Dolosigranulum, Globicatella, Carbobacterium,Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphera, Leuconostoc,Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus dan Weissela. Sedangkan genus Lactobacillus dibagi lagi menjadi 3 subgenera yaitu Betabacterium, Streptobacterium dan Thermobacterium.

Berdasarkan kemampuannya dalam metabolisme glukosa dan produk akhir yang dihasilkan, BAL dibagi menjadi dua kelompok yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. BAL homofermentatif merupakan BAL yang memproduksi asam laktat sebagai produk utama atau satu-satunya produk hasil fermentasi glukosa, sedangkan BAL heterofermentatif yaitu BAL yang memproduksi laktat,

CO2dan etanol dari metabolisme heksosa. BAL homofermentatif digunakan dalam

pengawetan makanan karena produksi asam laktat dalam jumlah besar dan mampu menghambat bakteri penyebab kebusukan makanan dan bakteri patogen lainnya. Sedangkan golongan heterofermentatif lebih ditujukan kepada pembentukan flavourdan komponen aroma, seperti asetaldehid dan diasetil (Farida, 2006).

Bakteri asam laktat disebut sebagai probiotik, probiotik adalah mikroorganisme hidup yang mana ketika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup memberi manfaat kesehatan terhadap inangnya (FAO/WHO,2001 dalam Velez et al., 2007).

Kemampuan Bakteri Asam Laktat menghasilkan senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba lainnya menjadikannya sebagai agen pengendali hayati secara biologi yang aman dan ramah lingkungan. Berdasarkan penelitian sebelumnya dilakukan pengujian kemampuan BAL dalam menghambat patogen Streptococcus agalactiae diantaranya Pediococcus pentosaceus. Selanjutnya beberapa spesies BAL yang memiliki aktivitas penghambatan yaitu Weissella confuse dan spesies dari genus Lactobacillus yaitu L. acidophilus, L. brevis, L. fermentum, dan L. lactis(Sernaet al, 2012dalamMayasari, 2013).

Bakteri asam laktat memiliki aktivitas antimikroba karena memproduksi asam organik yaitu asam laktat, asam format dan asam asetat, diasetil, H2O2,

CO2serta bakteriosin. Senyawa-senyawa lain yang juga diproduksi oleh BAL dalam

jumlah yang lebih kecil dari pada asam laktat dan asetat ialah asam format, asam lemak bebas, ammonia, etanol, H2O2, diasetil, asetoin, enzim bakteriolitik,

bakteriosin, antibiotik dan beberapa senyawa penghambat lain yang belum ditetapkan atau belum teridentifikasi sama sekali. Akumulasi produk akhir berupa asam akan menyebabkan penurunan pH yang akan menghasilkan penghambatan yang luas terhadap mikroorganisme, termasuk bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif. Diasetil dapat menghambat baik mikroba patogen maupun pembusuk dan paling efektif terhadap bakteri Gram-negatif (Nopsagiarti, 2007).

BAB 3

BAHAN DAN METODE

Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei sampai dengan Desember 2014 bertempat di laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain tabung reaksi, cawan petri, pro pipet, pipet serologi, spatula, jarum ose, autoklaf, inkubator, beaker glass, bunsen, mikroskop cahaya, objek glass, shaker, spektrofotometer, hotplate, dan vortex. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain Osphrenomus gouramysehat yang dijual secara komersial,Lactobacillussp. isolat Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi USU,E. tardakoleksi Balai Riset Perikanan Air Tawar Sempur Bogor, akuades, alkohol 70%, larutan Mc Farland, H2SO4 1 N, NaOH 1 N, media deMan’s Rogosa Sharpe agar(MRSA), deMan’s

Rogosa Sharpe broth(MRSB), mediaMuller Hinton agar(MHA), larutan pepton steril, lempeng sisik ikan gurame, dan lempeng PVC.

3.3 Rancangan Percobaan

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif yang dimulai dengan isolasi dan karakterisasi BAL dari sumber isolasi usus ikan gurame (O. gouramy) sehat sebanyak 4 ekor dengan variasi berat dan masing-masing dari tempat yang berbeda. Penapisan atau seleksi BAL yang di isolasi dari usus ikan gurame danLactobacillus sp. yang sudah di isolasi dari usus ikan nila (isolat Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi USU) terhadap Edwardsiella tarda. Identifikasi BAL isolat potensial. Produksi senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL dan uji aktivitas senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL isolat potensial terhadap E. tardapada kepadatan sel 108CFU/mL. Pembentukan sel biofilmE. tardapada sisik ikan dan plastik PVC dan pengendalian biofilm dengan senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL. Data diperoleh disajikan dalam gambar, tabel maupun grafik.

3.4 Prosedur Penelitian

Isolasi bakteri asam laktat dilakukan menurut metode Bucio et a., (2006) dengan modifikasi. Saluran pencernaan ikan gurame sehat dipisahkan dari rongga tubuh, diambil, disayat untuk kemudian dibersihhkan isinya. Tiriskan kemudian dinding usus bagian dalam dikerik dengan menggunakan spatula steril. Cairan mukosa usus diambil sebanyak 1 mL dan dihomogenkan di dalam 9 mL larutan PBS (Phosphat Buffer Saline) kemudian dilakukan pengenceran hingga 10-8secara berseri. Dari setiap pengenceran diambil 0,1 ml dan disebarkan pada medium MRS agar, lalu di inkubasi pada suhu 28 0C selama 24-48 jam hingga didapat 30-300 CFU/mL sel BAL. Koloni yang tumbuh terpisah, berwarna putih pada MRSA dimurnikan dengan metode kuadran gores hingga memperoleh koloni murni. Kultur murni ditandai dengan morfologi yang seragam. Identifikasi awal didasarkan atas pengamatan morfologi dan uji katalase masing-masing isolat BAL berdasarkan ciri-ciri awal tersebut dicocokkan dengan Bergeys Manual of Determinative of Bacteriology 9th edirion (Holtet al. 2000).

a. Uji morfologi dan Pengecatan Gram

Isolat murni ditumbuhkan pada media cair MRS dan diinkubasikan selama 24 jam, pada suhu 30 o_{C kemudian dilakukan pengecatan Gram sekaligus}

diamati bentuk selnya (bulat, bulat batang, tetrad, batang). b. Uji motilitas

Uji motilitas dilakukan dengan menumbuhkan kultur pada media SIM dan diinkubasi selama 48 jam, pada suhu 30o_{C. Motilitas ditentukan atas dasar}

rata tidaknya pertumbuhan bakteri pada media di dalam tabung reaksi. Bakteri yang tidak motil hanya tumbuh terbatas pada bekas goresan jarum inokulasi.

c. Uji Biokimiawi (Uji Katalase, Uji Sitrat dan Uji TSIA)

Uji katalase dilakukan dengan meneteskan larutan H2O2 3% pada kultur

muda (umur 24 jam). Sifat reaksi terhadap uji katalase ditentukan dengan pemunculan gelembung gas yang memberikan indikasi pembentukan gas CO2. Uji sitrat dilakukan dengan media SCA(Simon Citrat Agar), uji positif

terjadi jika terdapat perubahan warna pada media yang semula berwarna hijau menjadi biru. Uji TSIA dilakukan dengan media miring TSIA. Gores permukaan media dengan ose bengkok, kemudian tusuk bagian tengah

media secara lurus dan diinkubasi selama 24-48 jam. Uji positif dilihat dengan adanya endapan hitam.

3.4.2 Seleksi BAL Potensial terhadapE. tarda

Seleksi BAL potensial dalam menghambat bakteri E. tarda dilakukan dengan metode Banerjee et al., (1999) untuk menentukan isolat terpilih yang nantinya akan diteruskan pada pengujian selanjutnya. E. tarda sebanyak 5-10 koloni dikultur dalam 50 mL media NB dan diinkubasi 24 jam pada suhu 28 0C disetarakan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm OD0,5diusap

kultur cair patogenE. tardadengancotton budsterilpada media MHA, uji antagonis dengan meneteskan kultur cair BAL ke dalam kertas cakramdan diletakkan pada media MHA yang telah diusap kultur cair patogenE. tarda, diinkubasi pada suhu 28 0Cselama 24-48 jam. Diameter zona penghambatan diukur dengan mengamati zona bening yang terbentuk

3.4.3 KurvaPertumbuhan Isolat BAL

Sebanyak 5 ose kultur BAL terpilih dimasukkan kedalam 30 mL media cair MRSB, kemudian diinkubasi pada 28 o_{C.pada rentang 3 jam selama 24 jam,}

dihitung nilai kerapatan optik atau optical density (DO) isolat terpilih BAL dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm menurut metode Hadioetomo (1990).

3.4.4 Produksi Ekstrak kasar Senyawa anti mikrobaBAL

Produksi Senyawa Antimikroba dilakukan dengan memodifikasi metode Delgado (2001) yaitu dengan memproduksi senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL yang berasal dari kultur cair berumur 27 jam. Kultur cair ditambahkan sebanyak 10 mL kedalam 400 mL media NB, di inkubasi pada suhu 28 0C selama 27 jam. Kemudian sebanyak 100 mL kultur disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan penyaringan senyawa antimikrpoba dengan kerrtas saring 0,22 µm (MS®Syringe filter) sehingga diperoleh ekstrak kasar seenyawa antimikrroba BAL.

3.4.5 Uji Aktivitas Ekstrak kasar Senyawa anti mikrobaBAL terhadapE.tarda Uji ini dilakukan untuk menyeleksi BAL potensial. Sebanyak 25 µL E. tarda.diinokulasikan pada media MHA diusap menggunakan cotton bud hingga merata. Sebanyak 30 µL ekstrak kasar senyawa anti mikroba kultur BAL diteteskan pada kertas cakram, diletakkan di permukaan cawan petri yang berisi biakan patogen uji E. tardaSelanjutnya diinkubasi pada suhu 28oC selama 24 jam. Diameter zona penghambatan diukur dengan mengamati zona bening yang terbentuk.

3.4.6 Pembentukan dan Penghitungan Sel BiofilmE. tarda(Jamilah dan Priyani, 2012).

Lempeng permukaan padat dibuat untuk pengujian in vitro dalam hal ini permukaan plastik PVC dan sisik ikan. Lempeng palastik PVC dipotong seluas 1 cm2_{, kedua lempeng dicuci dengan larutan detergen pada bak sonikator selama 15}

menit, kemudian lempeng plastic PVC dan sisik ikan dibungkus dengan alumunium foil lalu di sterilkan dengan autoklaf selama 15 menit tekanan 1 atm pada suhu 121

0_{C. Sisik ikan dan plastic PVC digunakan sebagai analogi permukaan padat di air}

kolam.

Isolat murniE. tardaditumbuhkan pada media NB sebanyak 50 ml dengan konsentrasi sel 108CFU/ml dalam labu Erlenmeyer. Secara terpisah masing-masing lempeng dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer, dan dalam labu Erlenmeyer lainnya dimasukkan lempeng secara bersamaan, kemudian diaerasi selama 15 menit setiap harinya pada suhu 28 oC. pembentukan biofilm diamati pada periode 1, 3, dan 5 hari untuk melihat penempelan sel biofilm. Lempeng diangkat dari kultur , masing-masing dibilas sebanyak tiga kali dengan 10 ml akuades steril kemudian dimasukkan ke dalam 9 ml larutan garam fisiologis (NaCl 0,85%) yang ditambah dengan 0,5 g manik-manik kaca mikro (glass bead), kemudian divortex untuk melepas sel biofilm selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan pengenceran berseri. Sebanyak 0,1 ml kultur disebar pada media PCA, diinkubasi pada suhu 28 oC selama 24 jam. Setelah itu dilakukan perhitungan jumlah sel dengan metode TPC. Perlakuan diulang sebanyak 2 kali. Kontrol yang berupa larutan yang berisi masing-masing lempeng tanpa penambahan selE. tarda.

3.4.7 Pengendalian Sel BiofilmE. tardadengan ekstrak kasar senyawa Anti mikroba BAL(Jamilah dan Priyani, 2012)

Lempeng plastic PVC dan sisik ikan yang telah ditumbuhi biofilmE. tarda masing-masing dimasukkan ke dalam tabung steril yang berbeda, lempeng sisik dan plastic PVC yang berada dalam media yang sama dimasukkan kedalam tabung steril lalu ditambahkan masing-masing ekstrak kasar senyawa anti mikroba BAL terpilih, pada suhu 28oC dengan waktu kontak 1 jam. Kemudian di aerasi selama 2 menit setiap 15 menit sekali. Setelah waktu kontak 1 jam lempeng diangkat dari kultur. Masing-masing dibilas sebanyak 3 kali dengan 10 ml akuades steril kemudian dimasukkan ke 9 ml larutan garam fisiologis ( NaCl 0,85%) yang ditambah dengan 0,5 g manik-manik kaca mikro (glass bead), kemudian divortex untuk melepas sel biofilm selama 2 menit. Sebanyak 0,1 ml kultur disebar pada media PCA secara aerobic, diinkubasi pada suhu 28 o_{C selama 24 jam. Setelah itu dilakukan}

perhitungan jumlah sel dengan metode TPC. Perlakuan diulang sebanyak 2 kali. control berupa larutan yang berisi masing-masing lempeng tanpa penambahan sel biofilm E. tarda yang direndam dengan akuades steril, lalu diperlakukan sama dengan perlakuan.

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat diisolasi dari saluran pencernaan ikan gurame dan ditumbuhkan pada media MRSA pada suhu 28 oC selama 24-48 jam. Dari hasil isolasi diperoleh 8 isolat bakteri yang berbeda dari segi warna, bentuk, tepian, dan elevasi koloni dengan kode PG 1 sampai dengan PG 8. Selanjutnya, isolat yang berbeda dipisahkan dengan menggunakan metode gores sehingga didapatkan koloni murni untuk keperluan karakterisasi. Pada media MRSA yang digunakan tersedia sumber nitrogen yang cukup untuk pertumbuhan BAL (Kim et al, 2006) dan merupakan media selektif untuk pertumbuhan BAL (De Man et al, 1960). Selain itu pada penelitian sebelumnya juga sudah diisolasi 6 BAL potensial yang akan digunakan pada penelitian ini dengan kode AK 1, AK 3, AK 5, EK 2, EK 5, US 7 yang masing-masing sudah di karakterisasi secara morfologi dan biokimia.

Berdasarkan pengamatan morfologi yang dilakukan pada 8 isolat BAL, warna koloni BAL umumnya krem, putih susu, dan krem kekuningan. Bentuk koloni bervariasi diantaranya sirkular dan rhizoid. Tepi koloni berombak dan bundar. Elevasi dari koloni BAL hasil isolasi juga bervariasi diantaranya datar, timbul dan berbukit. Selanjutnya dilakukan uji karakterisasi biokimia yang meliputi uji sitrat, uji motilitas, uji gelatin, uji katalase, uji pati dan uji hidrogen sulfida. Secara umum BAL menunjukkan uji positif untuk motilitas, uji negatif untuk gelatin kecuali pada PG 3, uji negatif untuk katalase, uji negatif untuk sitrat, dan uji positif untuk fermentasi glukosa, sukrosa, dan laktosa. Hasil karakterisasi morfologi dan uji biokimia disajikan dalam Tabel 4.1 berikut:

Tabel 4.1. Karakteristik morfologi dan Biokimia Isolat BAL (* dikarakterisasi oleh Mayasariet al2013)

Kode Isolat Ciri Morfologi koloni (bentuk, tepi, elevasi, warna) Gr am B en tu k se l TSIA E n d ap an R eta k an Ge la tin Ka ta la se M o tilita s Pati Sitrat PG1 PG2 PG3 PG4 PG5 PG6 PG7 PG8 *AK1 *AK3 *AK5 *EK2 *EK5 *US7 Sirkular,bundar ,rata, krem Rhizoid,berombak, rata, krem keputihan Sirkular,bundar, timbul, krem Sirkular,bundar, rata, putih Rhizoid, berombak, rata, krem kekuningan Rhizoid dan lebar,berombak, rata, krem Sirkular,bundar, timbul, putih susu

Rhizoid, bundar, timbul, putih susu

bulat, tidak teratur, timbul, putih susu Krem, bulat, tidak teratur, timbul Putih susu, bulat,

halus, timbul Putih susu, bulat,

halus, timbul Putih susu, bentuk

-I, gerigi, timbul Krem, filiform, lobat, umbonat + + + + + + + + + + + + + + kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus kokus Basil kokus Basil kokus -+ -+ -+ -+ + + + + + + + + + + + + +

-4.2. Uji Daya Hambat Isolat Bakteri Asam Laktat Terhadap Pertumbuhan Bakteri PatogenEdwardsella tarda

BAL hasil isolasi, selanjutnya diuji antagonis dengan isolat patogen E. tarda. Uji antagonis dilakukan untuk melihat kemampuan BAL dalam menghambat pertumbuhan E. tarda. Biakan cair BAL sebanyak 25 µL diteteskan pada kertas cakram, diletakkan di permukaan cawan petri yang berisi biakan patogen uji E. tarda. Dari hasil uji antagonis, 14 isolat BAL yang telah diisolasi seluruhnya mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen E. tarda dengan ukuran zona hambat yang berbeda-beda (Tabel 4.2)

Tabel 4.2. Diameter zona hambat BAL terhadapE. tardapada konsentrasi sel 108CFU/mL

Kode isolat Besar zona hambat (mm)

PG 1 6

PG 2 7, 65

PG 3 7, 1

PG 4 7, 5

PG 5 7, 25

PG 6 7, 15

PG 7 8, 15

PG 8 7, 5

AK 3 7, 05

US 7 7, 7

EK 2 7, 6

AK 1 7

EK 5 7, 4

AK 5 7, 5

Berdasarkan hasil uji antagonis, ke-14 isolat BAL yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan gurame mampu menghambat pertumbuhan bakteriE. tarda yang merupakan bakteri patogen penyebab penyakit pada ikan air tawar. Ke-14 isolat BAL yang diujikan, isolat PG 7 merupakan isolat yang memiliki

zona hambat tertinggi yaitu 8,15 mm dan selanjutnya isolat US 7 yaitu 7,7 mm (Gambar 4.1).

Perbedaan kemampuan masing-masing isolat BAL dalam menghambat pertumbuhan E. tarda dapat disebabkan oleh perbedaan spesies BAL. Menurut Cahyaningsih (2006), spesies BAL yang berbeda akan menghasilkan penghambatan dan aktivitas yang berbeda pula karena perbedaan komponen metabolit yang dihasilkan, sehingga dapat dinyatakan bahwa isolat BAL yang telah diisolasi dari saluran pencernaan ikan gurame pada penelitian ini terdiri dari beberapa spesies yang berbeda.

Diameter zona hambat terhadap E. tardayang didapat dalam penelitian ini tergolong kuat, pernyataan ini didukung oleh hasil penelitian Panet al. (2009) yang menyatakan bahwa, zona bening yang memiliki diameter zona hambat 0-3 mm tergolong lemah, diameter hambat 3-6 mm baik, diameter hambat lebih besar dari 6 tergolong kuat. Berdasarkan hasil uji antagonis yang diperoleh, isolat PG 7 dan US 7 dipilih sebagai isolat potensial karena memiliki zona hambat tertinggi.

Gambar 4.1 Diameter zona hambat isolat BAL potensial (a) PG7 (b) US7

Mekanisme penghambatan bakteri BAL terhadap pertumbuhan bakteri patogen dapat disebabkan oleh beberapa faktor antara lain senyawa antibakteri yang dihasilkan BAL mampu merusak dinding sel sehingga menyebabkan terjadinya lisis, mengubah permeabilitas membran sitoplasma sehingga menyebabkan kebocoran nutrien dari dalam sel. Selain itu, BAL yang bersifat homofermentatif maupun heterofermentatif memanfaatkan substrat yang tersedia pada lingkungannya dengan hasil akhir berupa energi dan asam-asam lemah seperti asam laktat, asam asetat serta CO. Keberadaan asam-asam lemah terutama asam laktat sebagai produk metabolisme dapat bersifat sebagai salah satu faktor penghambat

bagi pertumbuhan bakteri patogen seperti E. tarda karena dapat menurunkan pH lingkungan di sekitar medium yang akan merusak protein/enzim-enzim bakteri patogen(Gourama dan Bullerman ,1995).

4.3 Fase Pertumbuhan BAL

Selanjutnya dua isolat terpilih (PG 7 dan US 7) dilihat kurva pertumbuhannya untuk menentukan waktu panen produksi senyawa antimikroba. Pertumbuhan isolat BAL ditandai dengan meningkatnya nilai densitas (kekeruhan) medium selama rentang waktu inkubasi. Penentuan kurva pertumbuhan BAL bertujuan untuk mengetahui waktu yang menunjukkan fase stasioner pada isolat BAL. Berkurangnya nutrisi pada fase stasioner membuat sel bakteri mempertahankan kelangsungan hidupnya dengan cara mengeluarkan senyawa antibakteri untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain. Fase stasioner adalah fase yang paling tepat untuk memproduksi senyawa antimikroba (Gaman dan Sherrington, 1994). Kurva pertumbuhan isolat PG7 dan US7 dapat dilihat dari Gambar 4.2 berikut:

Gambar 4.2 : Kurva pertumbuhan isolat BAL SPG 7 dan US7 pada medianutrient broth, suhu 280_{C selama 30 jam}

Berdasarkan data yang diperoleh, terlihat bahwa isolat BAL masih mengalami fase adaptasi (lag) yaitu pada jam ke-0 hingga jam ke-3. Pada fase lag ini, BAL berada dalam tahap penyesuaian terhadap lingkungan yang baru atau adaptasi. Pada fase ini, mikroba mengalami suatu masa dimana selnya menjadi lebih besar

0.023

0.22 0.267

0.656 0.734

0.791 0.868

0.9 0.91 0.913

0.018 0.617 0.672 0.944 0.994 1.08 1.179 1.228 1.287 1.292 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 4 2 7 3 0

O P T ICA L D E N S IT Y ( O D ) = 6 0 0 N M

WAKTU INKUBASI (JAM)

tetapi jumlahnya tetap sama atau sedikit sekali terjadi perkembangan populasi meskipun metabolisme sel terus berlangsung (Gaman dan Sherrington, 1994).

Fase berikutnya adalah fase pertumbuhan logaritmik (log) yang diperoleh setelah jam ke-3 hingga mencapai pertumbuhan maksimum pada jam ke-21 inkubasi. Fase ini merupakan akhir fase lag yang ditandai dengan terus membelahnya sel mikroba. Selama fase log, sel membelah terus-menerus konstan dengan kecepatan pertumbuhan yang tinggi saat angka dan log dari angka kelompok sel terhadap waktu pada garis lurus (Pelczar and Chan, 2005).

Fase stasioner isolat BAL terlihat mulai jam ke-27 sampai jam ke-30. Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Khoiriyah et al., (2014), fase stasioner padaLactobacillus sp diperoleh pada jam ke-24 sampai jam 30 dan penelitian Yuliana (2008) fase stasioner BAL diperoleh pada jam ke-18 sampai jam ke-30. Hasil tersebut tidak terlalu berbeda dengan hasil pada penelitian ini yang memungkinkan fase stasioner BAL dapat diperoleh kira-kira jam ke-18 sampai jam ke-30. Mangunwidjaja dan Suryani (1994), menyatakan bahwa ukuran sel pada fase stasioner menjadi lebih kecil-kecil karena sel tetap membelah meskipun zat-zat nutrisi sudah habis. Pada fase ini laju pertumbuhan akhirnya menurun yang biasanya disebabkan oleh kekurangan faktor pertumbuhan seperti vitamin dan unsur mineral (Gaman dan Sherrington, 1994).

4.4 Uji Antagonis Ekstrak Kasar Senyawa Antimikroba BAL Terhadap Edwardsiella tarda

Setelah waktu awal stasioner diketahui berdasarkan kurva pertumbuhan isolat PG 7 dan US 7, maka selanjutnya dilakukan produksi senyawa antimiroba pada jam ke-22 inkubasi. Selanjutnya senyawa antimikroba ekstrak kasar diujikan terhadap bakteri patogen E. tarda yang dibandingkan dengan antibiotik komersial kloramfenikol. Luas zona hambat ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL disajikan dalam Tabel 4.3

Tabel 4.3 : Diameter zona hambat senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL PG 7 dan US7 terhadap E. tarda pada konsentrasi sel 108 _CFU/ml

Diameter zona hambat (mm) TerhadapEdwardsiella tarda Supernatan BAL PG 7 11

US 7 10,5 Kloramfenikol 13,5

Berdasarkan tabel 4.3 dapat dilihat bahwa luas zona hambat terhadap patogen E. tarda oleh senyawa antimikoba ekstrak kasar PG 7 lebih tinggi bila dibandingkan dengan sel bakteri PG7 yaitu 8,15 mm menjadi 11 mm (Gambar 4.3). Hal tersebut dapat terjadi karena kemampuan BAL dalam menghasilkan asam-asam organik sehingga menyebabkan pH medium menurun dan merusak enzim bakteri patogen. Selain penurunan pH, Bakteri Asam Laktat mampu menghambat pertumbuhan bakteri lain dengan cara menghasilkan CO2, H2O2, dan bakteriosin

(Cahyaningsih, 2006).

Antibiotik kloramfenikol membentuk zona hambat yang lebih tinggi dibandingkan senyawa antimikroba ekstrak kasar yaitu sebesar 13,5 mm. Hal tersebut dapat terjadi karena kloramfenikol merupakan antibiotik yang memiliki kemurnian yang sudah teruji sementara senyawa antimikroba yang digunakan dalam penelitian ini merupakan ekstrak kasar yang belum dimurnikan. Selain itu kloramfenikol merupakan antibiotik bakteriostatik berspektrum luas yang aktif terhadap bakteri Gram positif maupun negatif. Pada penelitian yang telah dilakukan oleh Madigan dan Martinko (2006), penghambatan bakteri patogen dengan menggunakan antibiotik kloramfenikol diperoleh luas zona hambat mencapai 20 mm, dinyatakan bahwa antibiotik akan menghambat proses sintesis dinding sel. Tekanan osmotik dalam sel mikroba lebih tinggi daripada di luar sel, sehingga kerusakan dinding sel mikroba akan menyebabkan terjadinya lisis yang merupakan dasar dari efek bakterisidal terhadap mikroba yang peka. Namun penggunaan kloramfenikol perlu diawasi karena kloramfenikol adalah antibiotika pertama yang mempunyai efek terhadap rikets yang dapat menyebabkan efek hipersensitivitas (Hadisahputra dan Harahap, 1994).

Gambar 4.3 Diameter zona hambat senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL terhadap pertumbuhan bakteri patogen dengan antibiotik pembanding kloramfenikol (a) senyawa antimikroba ekstrak kasar PG 7 dan Kloramfenikol terhadap Edwardsella tarda (b) senyawa antimikroba ekstrak kasar US 7 dan Kloramfenkol terhadapEdwardsiella tarda

4.5 Pembentukan dan pengendalian biofilmE. tarda

Pembentukan biofilm dilakuan pada bakteri uji Edwarsella tarda yang dibentuk pada dua lempeng permukaan padat yaitu sisik ikan gurame yang dianalogikan sebagai permukaan biotik dan plastik PVC dianalogikan sebagai permukaan abiotik pada lingkungan akuakultur. Perhitungan jumlah sel E. tarda yang dibentuk pada sisik ikan gurame dan PVC dilakukan pada rentang waktu yang berbeda yaitu hari ke-1, ke-3, dan ke-5.E. tardamampu membentuk biofilm pada permukaan sisik ikan gurame pada hari ke-1 sebesar 3,6 x 1011 CFU/lempeng dan permukaan plastik PVC sebesar 2,4 x 1011CFU/lempeng. Pada rentang hari ke-3 terlihat adanya peningkatan sel biofilm, pada permukaan sisik ikan sebesar 5,7 x 1013 CFU/lempeng dan pada permukaan plastik PVC sebesar 13,2 x 1013CFU/lempeng.Peningkatan jumlah sel biofilm dipengaruhi oleh ketersediaan nutrisi pada media. Pada hari ke-5 jumlah sel biofilm mengalami penurunan, pada permukaan sisik ikan sebesar 5 x 1012CFU/lempeng dan pada permukaan plastik PVC sebesar 10,4 x 1012CFU/lempeng. Adanya penurunan jumlah sel biofilm pada sisik dan PVC pada hari ke-5 diduga karena sel biofilm yang baru terlepas dari sel yang lebih tua membentuk sel planktonik dan beberapa sel yang mengalami kematian karena ketersediaan nutrisi yang berkurang. Sel-sel yang terlepas dari biofilm dapat disebabkan oleh penurunan ketersediaan nutrisi, sifat hidrofobik biofilm, dimana sifat ini akan meningkat seiring dengan usia sel pada biofilm

a _{Kloramfenikol} b

Kloramfenikol

(Donlan, 2002). Terbatasnya nutrien mengharuskan bakteri menyesuaikan diri dalam memperoleh sumber energi, misalnya terjadinya rounding (sel menjadi bulat) dan dwarfing (mengecil ukuran dan volume) pada morfologi sel bakteri (Silitongaet al, 2012).

Menurut Gunardi (2010), pembentukan sel biofilm dimulai dari beberapa bakteri yang hidup bebas (sel planktonik) melekat pada suatu permukaan kemudian memperbayak diri dan membentuk satu lapisan tipis (monolayer) biofilm. Pada saat ini pembelahan akan berhenti selama beberapa jam dan sel planktonik mengalami transisi menjadi sel planktonik dengan fenotip biofilm. Sel biofilm berbeda secara metabolik dan fisiolik dari sel planktoniknya. Selanjutnya sel biofilm akan menghasilkan EPS yang akan melekatkan mereka pada suatu permukaan dan melekatkan diri satu sama lain untuk membentuk suatu mikrokoloni. Jika sel-sel terus melanjutkan pertumbuhannya dan membentuk lapisan yang makin menebal, maka mikroba yang melekat pada permukaan terdalam akan kekurangan zat-zat nutrisi dan terjadi akumulasi produk buangan yang bersifat toksik. Untuk mengatasi masalah ini mikrokoloni akan berkembang menjadi bentuk jamur yang mempunyai saluran atau pori-pori yang dapat dilewati oleh nutrisi dan produk metabolit dari semua sel.

Biofilm dapat tumbuh diberbagai permukaan, termasuk batu dan air, gigi, makanan, pipa, alat-alat medis dan jaringan implant. Biofilm biasanya ditemukan pada substrat padat yang terendam atau terkena sebagian oleh larutan air, meskipun mereka dapat pula berbentuk seperti tikar yang mengambang pada permukaan cairan dan juga pada permukaan daun, terutama pada iklim dengan kelembaban tinggi. Akibat sumber daya yang cukup untuk pertumbuhan, biofilm dengan cepat tumbuh menjadi makroskopis (Anonim, 2010).

Pada penelitian ini jenis permukaan padat yang digunakan untuk penempelan biofilm E. tarda adalah sisik ikan gurame dianalogikan sebagai permukaan biotik dan plastik PVC dianalogikan sebagai permukaan abiotik dan tidak memiliki perbedaan jumlah sel yang signifikan pada masing-masing permukaan.

Biofilm dikendalikan dengan senyawa antimikroba BAL terpilih yaitu PG7. Produksi senyawa antibakteri diperoleh pada jam ke-27 karena pada saat ini BAL

berada pada fase stasioner dan mikroba memproduksi senyawa antimikroba yang diduga mampu menurunkan jumlah sel biofilm yang melekat pada lempeng sisik dan PVC. Penurunan jumlah sel biofilm dipengaruhi oleh umur koloni bakteri biofilm. Pembentukan dan penurunan rata-rata jumlah sel biofilm E. tarda pada sisik ikan dan plastik PVC sebelum dan sesudah kontak 1 jam dengan senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL PG7 dapat dilihat pada Tabel 4.4 berikut:

Tabel 4.4. Pembentukan dan penurunan rata-rata Jumlah Sel BiofilmEdwardsiella tardapada Sisik Ikan dan Plastik PVC sebelum dan setelah kontak 1 jam dengansenyawa antimikrobaekstrak kasar BAL PG 7

Permukaan lempeng

Rata-rata jumlah sel CFU/lempeng sebelum dan setelah kontak dengan senyawa ekstrak kasar BAL

Hari ke-1 Hari ke-3 Hari ke-5 sebelum setelah sebelum setelah sebelum setelah Sisik 3,6 x 1011 _{6,6 x 10}9 _{5,7 x 10}13 _{4,9 x 10}11 _{3 x 10}12 _{3 x 10}10

PVC 2,4 x 1011 _{5,5 x 10}9 _{13,2 x 10}13 _{5,2 x 10}11 _{10,4 x 10}12 _{4,7 x 10}10

Tabel 4.4 menunjukkan bahwa sel biofilm masing-masing mengalami penurunan sebesar 18%baik pada permukaan sisik ikan maupun plastik PVC. Hasil tersebut cenderung rendah dan diduga belum mampu mengendalikan sel biofilm, hal tersebut bisa terjadi karena resistensi biofilm terhadap senyawa antimikroba. Struktur dasar dan fisiologik dari biofilm membuat biofilm secara alami resisten agen antimikroba, antibiotik, desinfektan, maupun germisida. Faktor-faktor yang diperkirakan bertanggung jawab terhadap resistensi biofilm adalah penurunan penetrasi dari antimikroba dan ekspresi gen resistensi yang spesifik dimana biofilm terbungkus dalam matriks Extracellular Polymeric Subtances (EPS) yang dihasilkannya sendiri serta memperlihatkan adanya perubahan fenotip dari sel planktonik seperti karakteristik resistensi, hal tersebut membuat sel biofilm sulit untuk dikendalikan (Gunardi, 2010). Menurut Yunus (2000), semakin lama umur sel biofilm semakin sulit untuk dikendalikan. Pada penelitian ini umur biofilm adalah 1, 3, dan 5 hari yang cenderung singkat namun mengalami penurunan sebesar 18%. Hal tersebut mungkin terjadi karena biofilm sulit untuk dikendalikan. Pernyataan ini didukung dengan membandingkan hasil penelitian yang telah

dilakukan oleh Mayasari et al (2013), yang juga menggunakan ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL dalam mengendalikan sel biofilm Streptococcus agalactiae pada permukaan sisik ikan nila dan plastik PVC menunjukkan penurunan sebesar 15%. Selain itu, penurunan biofilm E. tarda yang cenderung rendah yaitu 18%, mungkin juga disebabkan oleh waktu kontak ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL terhadap biofilm yang cenderung cepat yaitu 1 jam. Sitepu et al (2013), juga melakukan penelitian yang sama yaitu pengendalian biofilm Mycobacterium fortuitum menggunakan ekstrak kasar senyawa antimikroba BAL dengan waktu kontak selama 30 menit dan mengalami penurunan sebesar 13%. Perbedaan waktu kontak yang berbeda juga menghasilkan penurunan jumlah sel biofilm yang berbeda, sehingga dapat dinyatakan bahwa waktu kontak ekstrak kasar senyawa antimikroba dengan permukaan padat tempat penempelan biofilm juga memiliki pengaruh terhadap penurunan jumlah sel biofilm.

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan gurame mampu menghambat pertumbuhan E. tarda dengan membentuk zona hambat tertinggi sebesar 8,15 mm yaitu pada isolate dengan kode PG7 diikuti dengan US7 sebesar 7,7 mm. E. tarda mampu membentuk sel biofilm pada permukaan sisik ikan gurame dan lempeng PVC maksimal pada hari ke-3 sebesar 1013 CFU/lempeng dan hanya mengalami penurunan sebesar 18% setelah kontak dengan senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL PG7, hal tersebut menunjukkan bahwa biofilm E. tarda tahan terhadap senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL PG7.

5.2 Saran

1. Perlu penelitian lanjutan mengenai variasi waktu kontak dalam pengendalian biofilmE. tardauntuk melihat kemampuan pelepasan biofilm dengan rentang waktu kontak lebih lama

2. Perlu penelitian lebih lanjut mengenai variasi waktu kontak yang lebih singkat dalam pembentukan biofilmE. tardaagar ditemukan waktu tertinggi yang tepat pada pembentukan biofilm

3. Perlu karakterisasi lebih jauh terhadap senyawa antibakteri isolate BAL potensial

DAFTAR PUSTAKA

Alamsyah, S., Azis H.S., Sriwulan., Komang G., Wiryawan. 2009. Mikroflora saluran pencernaan ikan gurame (Ospronemus gouramyLacepede). Jurnal Ilmu Kelautan dan Perikanan.19(1): 66-67.

Banerjee U.C., Sani R.K., Azmi W. and Soni R. 1999. Thermostable alkaline

protease from bacillus brevis and it’s characterization as a laundry detergent additive.J. Proc. Biochem. 35: 213-219

Bucio A., Hartermink R., Schrama J.W., Verreth J. and Rombouts F.M. 2006. Presence of lactobacilli in the intestinal content of freshwater fish from a river and from a farm with a recirculation system. J. Food. Microbiol. 23 (5) : 476-482

Carnevali O, Zamponi MC, Sulpizio R, Rollo A, Nardi M, Orpianesi C, Silvi S, Caggiono M, Polzonetti AM & Cresci A (2004) Administration of probiotic strain to improve sea bream wellness during development. Aquaculture Int 12:377–386

Daulay, D. 1991. Fermentasi Asam Laktat Dalam Pengolahan Pangan PAU Pangan dan Gizi. IPB. Bogor.

Delgado, A., Brito, Fevereiro, P., Peres, C., and Marques, J.F. 2001. Antimicrobial activity ofL. plantarumisolated from a traditional lactid acid fermentation of table olives. EDP Sciences 8: 203-215

De Man, J.C., Rogosa, M.E., Sharpe. 1960. A Medium for the cultivation of Lactobacilli. J.Appl. Bacteriol.,23, 130-135

Djauhari, R. 2006. Identifikasi potensi bakteri pathogen pada budidaya ikan Betok (Anabas testudineusBloch).J of trop fisheries1(1):71.

Donlan, R.M, and Costerton, J.W. 2002. Biofilm : Survival Mechanism of Clinically Relevant Microorganism. J.Clin Microbial Rev. 15: 167-193 Farida, E. 2006. Seleksi dan Pengujian Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik

Hasil Isolat Lokal serta Kemampuannya dalam menghambat Selusi Interlefkin-8 dari alur sel HCl 116. Tesis. Program Pasca Sarjana. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Firma, Amalia R.R., Sari U., Chusbul C., Amri A.S. 2012. Deteksi Edwardsiella tarda pada ikan Lele (Clarias sp. ) Dengan metode Fluorescent Antibodu Tekhnique (FAT).Jurnal Akuakultur Indonesia. 11(1) : 97-98.

Flemming, H.C. 2008. Why Microorganism and the Problem of Biofouling. Springer Verlag Berlin Heidelberg. Springer series on biofilms. Biofilm Centre, UniversitybOf Duisburg-Essen, Duisburh. Geremany

Gaman, P.M. dan K.B. Sherrington. 1994. Pengantar Ilmu Pangan Nutrisi dan Mikrobiologi. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Hlm 317. Gunardi, W.D. 2010. Peranan Biofilm dalam Kaitannya dengan Penyakit Infeksi

Universitas UKRIDA. Jakarta Barat

Hadioetomo, R.S. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia, Jakarta. Harahap, D., Jamilah I., Rusmallin H. 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam

Laktat Perairan Tawar Dalam Menghambat BakteriAeromonas hydrophila. J. Biosains UNIMED 1(3):48

Hatmanti, A., Nuchsin R., Dewi. J.,. 2009. Screening bakteri penghambat untuk bakteri penyebab penyakit pada budidaya ikan kerapu dari perairan Banten dan Lampung.Makara Sains.13(1): 81.

Holt, J.G., Kreig, N.R., Sneath, P.H.a., Staley, J.t., Williams, S.T. 2000. Bergey’s

Manual Of Determinative Bakteriology. Ninth Edition. Philadepia. Lippincott-Williams and Wilkins.

Hawke, J.P. 2003.Edwardsiella tardaSepticemia. School of Veterinary Medicine. Balton Rouge.

Irianto, A. 2005. Patologi Ikan Teleestei. Edisi ke-1. Yogyakarta. Gadjah Mada University Press, pp 157

Jamilah, I., dan Priyani, N., 2012. Efektivitas Bacillus sp. Penghasil Senyawa Antimikroba dalam Membunuh Sel Biofilm Patogen Opurtunis pada Budidaya Udang. Laporan Akhir Penelitian Desentralisasi Skim Hibah Bersaing. Lembaga Penelitian Universitas Sumatera Utara.

Janda, J.M. and Abbort. 1993. Infection Assosiated with the genus Edwardsiella tardain Human disease.Clin. Inf. Dis. 17 : 742.

Judoamidjojo, M., A.A. Darwis, dan E.G. Sa’id. 1990. Teknolologi Fermentasi.

Rajawali Pers. Jakarta. hlm 333

Kim, S., Nonaka L., and Suzuki S. 2004. Occurrence Of Tetraclycline resistance genes tet (M) and tet (S) in bacteria from marine aquaculture sites. FEMS Microbial Letters 237 : 147-156.

Mangunwidjaja, D. dan A. Suryani. 1994. Teknologi Bioproses. Penerbit Swadaya. Jakarta. hlm 394

Marshall, K.C. 1992. Biofilms: An Overview of Bacterial Adheison, Activity, and Control at surfaces. ASM News 58: 202-207.

Mayasari, U., Jamilah I., Rusmarllin H. 2013. Penapisan dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Asal Perairan Tawar Lokal dalam Menghambat Patogen Streptococcus agalactiae. J. Biosains UNIMED. 1(3): 9

Narwitani, Siti. 2010. Lethal Concentration 50% (LC-50) Empat isolat Edwardsiella tardaPada ikan air tawar di Indonesia.J.Sain.Vet. 2(28) : 52 Nurhajati, J.S., R. Sulistijowati., dan I. Amaliah. 2009. The Influence of Giving

Various Concentrations and Method of Inoculum Lactobacillus acidophillus According to Immersion Time for Total Escherichia coli in Swordfish Stew (Auxis rochei). International Seminar Biotechnology. Unpad. Bandung.

Nopsagiarti, T. 2007. Pengaruh AplikasiLactobacillus coryneformis To8 terhadap cemaranAspergillus flavusdanSalmonella thypimuriumselama fermentasi biji kakao (Theobroma cacao L.). Tesis. Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi (diterjemahkan oleh Ratna Siri Hadieotomo). Jilid 2. Penerbit UI-Press. Jakarta, hlm 65 Pradana, M.S., Suprapto H., Sasmita R., 2009. Aplikasi Pseudomonas untuk

menekan pertumbuhan bakteri patogen di dalam pencernaan juvenile ikan bandeng (Chanos chanos Forskall) dan penguraian bahan organik. Surabaya: Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga.1(1):1 Prakash, B., Veeregowda, B.M. & Krishnappa, G. 2003. Biofilms : A survival

strategy of bacteria. Current Sci. 85(9): 1299-1307.

Qureshi, N., Annous,B.A., Ezeji,T.C., Karcher, P., & Maddox, I.S. 2005. Biofilm reactors for industrial bioconcersion processes: employing potential of enhanced reaction rates.Microbial Cell Factories4: 1-24.

Ratnawati, A., Purwaningsih, U., Kurniasih. 2013. Histopalogis Dugaan Edwardsiella tarda sebagai Penyebab Kematian Ikan Maskoki (Crassius auratus): Postulat Koch. JSV. 31(1) : 56-57.

Ray, 1992. Lactic Acid Bacteria:Current Advances in Metabolism, Genetic, and Application, Springer - Verlag, Germany

Sa’id, E.G. 1987. Bioindustri Penerapan Teknologi Fermentasi. PT. Melton Putra. Jakarta. hlm 317

Salminen, S., Wright, A. and Ouwehand, A.C. 2004. Lactid Acid Bacteria: Microbiological anf Functional Aspects. New York : Marcel Dekker, Inc.

Sastrawidana, D.K., Sukarta N. Uji Coba Teknologi Biofilm Konsorsium Bakteri pada Reaktor semianaerob-aerob Untuk Pengolahan Air Limbah di Industri Pencelupan Tekstil Skala Rumah Tangga.ISSN(2) : 195

Serna, L., Valencia, L.J., Campos, R. 2011. Lactid Acid Bacteria with Antimicrobial Activity Againts Pathogenic Agents causing of Bovine Mastitis. Biotecnological en el sectorAgroapecuario Agroindustrial. 9(1) : 97-104

Situngkir, R.U. 2005. Aplikasi Kultur Bakteri Asam Laktat dengan garam untuk mereduksi Aspergillus flavus dan Aflatoksin pada proses pengolahan kacang asin. Tesis. Program Pasca Sarjana. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Sitepu, D.R., Jamilah I., Rusmarllin H. 2013. Uji Antagonisme Mycobacterium fortuitum dengan menggunakan senyawa antibakteri ekstrak kasar bakteri asam laktat perairan tawar.J. Biosains Unimed. 1(3):40

Sugianti, B. 2005. Pemanfaatan obat tumbuhan tradisional dalam pengendalian penyakit ikan. Makalah Pribadi Falsafah Sains. Bogor: Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Hlm 2.

Sukadi, F., 2004. Kebijakan pengendalian hama dan penyakit ikan dalam mendukung akselerasi pengembangan perikanan budidaya. Disampaikan pada Seminar Nasional Penyakit Ikan dan Udang IV di Univ. Jenderal Soedirman, Purwokerto, 18–19 Mei 2004.

Sudiarja. 2007. Optimalisasi penggunaan faktor produksi dan analisis financial usaha pembesaran ikan gurame di kecamatan Pasawahan, kabupaten Kuningan. Skripsi. Departemen manajemen bisnis dan ekonomi perikanan kelautan. Fakultas perikanan dan ilmu kelautan. Institute Pertanian Bogor. Bogor.

Tauqhid. 2009. Efektivitas Pemberian Vaksin Streptococcusspp. pada Benih ikan nila (Oreochromis niloticus) melalui tekhnik perendaman untuk pencegahan penyakit Streptococcosis. Laporan Penelitian Hibah Penelitian Bagi Peneliti dan Perekayasa Departemen Kelautan dan Perikanan. Balai Riset Perikanan Budidaya air Tawar Pusat Riset Perikanan Budidaya Departemen Kelautan dan Perikanan.

Wirawati, C.U. 2002. Potensi Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari tempoyak sebagai probiotik. Tesis. Program Pasca Sarjana. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Lampiran 1.Isolasi Bakteri Asam Laktat (Bucioet al. 2006)

Bagian usus ikan Gurame (O. gouramy)

dicuci dan dibersihan dengan akuades steril dikerik dinding mukosa usus dengan spatula steril

dilakukan pengenceran hingga 10-8_{secara berseri}

dari setiap pengenceran 10-4 hingga 10-8diambil 0,1 mldan disebarkan pada medium MRS agar

diinkubasi pada suhu 280C selama 24-48 jam

Hasil

diambil cairan mukosa usus sebanyak 1 mL

dihomogenkan di dalam 9 mL larutan PBS (phosphat buffer saline)

Koloni BAL

disubkultur pada media MRSA baru sampai diperoleh biakan murni

Isolat murni BAL

Pewarnaan Gram Uji Biokimia

dikarakterisasi berdasarkan struktur dan warna koloni

diamati dengan

mikroskop Uji sitrat

Uji gelatin Uji motilitas Uji katalase Uji TSIA Hasil

diinokulasikan mikroba patogen dengan metode usap menggunakan cotton bud dengan absorbansi 0,5 standar Mc-Farland 108CFU/ml

diletakkan cakram kertas yang telah ditetesi dengan suspensi BAL pada jarak yang telah ditentukan

diletakkan cakram pembanding yaitu khloramphenikol

diinkubasi pada suhu 28-30oC selama 3 hari

diamati dan dihitung zona hambat yang terbentuk

Media MHA

dimasukkan kedalam 30 mL media cair MRSB diinkubasi pada 280C

dihitung nilai kerapatan optik atauoptical density(DO) isolat terpilih BAL dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm, pada rentang waktu 3 jam selama 24 jam

Lampiran 5. Produksi Senyawa Antimikroba BAL

diinokulasikan sebanyak 10 mL kedalam 400 media NB

diinkubasi pada suhu 280C selam 26 jam

disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C selama 15 menit sebanyak 100 mL kultur

disaringan senyawa antimikroba dengan kertas saring 0,22 µm (MS®Syringe filter)

Kultur BAL terpilih

Hasil

Kultur cair BAL berumur 26 jam

diinokulasikan mikroba patogen dengan metode usap menggunakan cotton bud dengan absorbansi 0,5 standar Mc-Farland 108CFU/ml

diletakkan cakram kertas yang telah ditetesi dengan suspensi senyawa ekstrak kasar BAL pada jarak yang telah ditentukan

diletakkan cakram pembanding yaitu khloramphenikol

diinkubasi pada suhu 28-30oC selama 3 hari

diamati dan dihitung zona hambat yang terbentuk

Media MHA

Lempeng permukaan padat

dibentuk masing-masing seluas 1 cm2

dicuci dengan detergen selama 15 menit pada bak sonikator, kemudian dibilas dengan akuades

dimasukkan lempeng padat pada masing-masing botol digoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 30 oC selama rentang waktu 1, 3, 5 hari

dibilas 3 kali dengan aquadest steril sebanyak 10 mL untuk masing-masing jenis lempeng

Hasil

disterilkan dengan autoklaf 121o_C

dimasukkan media NB sebanyak 50 mL menumbuhkan hingga 108CFU/mL isolatE. tardadi dalam botol uji

dmasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0,9% dan 0,5 gr serbuk kaca (glass bead)

divortex selama 2 menituntukmelepas biofilm tersisa

dilakukan pengenceran berseri

dihitung jumlah koloni yang tumbuh

dari setiap pengenceran disebar 1 mL pada media PCA

Glass bead(Manik-manik kaca) Lempeng plastik PVC

Lampiran 2. Alur Kerja Karakterisasi BAL

Isolat murni BAL

Pewarnaan Gram Uji Biokimia

dikarakterisasi berdasarkan struktur dan warna koloni

diamati dengan

mikroskop Uji sitrat

Uji gelatin Uji motilitas Uji katalase Uji TSIA Hasil

Lampiran 3. Seleksi BAL Potensial dalam menghambat pertumbuhanE. tarda

diinokulasikan mikroba patogen dengan metode usap menggunakan cotton bud dengan absorbansi 0,5 standar Mc-Farland 108CFU/ml

diletakkan cakram kertas yang telah ditetesi dengan suspensi BAL pada jarak yang telah ditentukan

diletakkan cakram pembanding yaitu khloramphenikol

diinkubasi pada suhu 28-30oC selama 3 hari

diamati dan dihitung zona hambat yang terbentuk

Media MHA

Lampiran 4. Kurva Pertumbuhan BAL

dimasukkan kedalam 30 mL media cair MRSB diinkubasi pada 280C

dihitung nilai kerapatan optik atauoptical density(DO) isolat terpilih BAL dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm, pada rentang waktu 3 jam selama 24 jam

Lampiran 5. Produksi Senyawa Antimikroba BAL

diinokulasikan sebanyak 10 mL kedalam 400 media NB

diinkubasi pada suhu 280C selam 26 jam

disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C selama 15 menit sebanyak 100 mL kultur

disaringan senyawa antimikroba dengan kertas saring 0,22 µm (MS®Syringe filter)

Kultur BAL terpilih

Hasil

Kultur cair BAL berumur 26 jam

Lampiran 6. Uji Aktivitas Senyawa Antimikroba Ekstrak Kasar BAL dalam menghambat pertumbuhan bakteriEdwardsiella tarda

diinokulasikan mikroba patogen dengan metode usap menggunakan cotton bud dengan absorbansi 0,5 standar Mc-Farland 108CFU/ml

diletakkan cakram kertas yang telah ditetesi dengan suspensi senyawa ekstrak kasar BAL pada jarak yang telah ditentukan

diletakkan cakram pembanding yaitu khloramphenikol

diinkubasi pada suhu 28-30oC selama 3 hari

diamati dan dihitung zona hambat yang terbentuk

Media MHA

Lampiran 7. Pembentukan sel BiofilmEdwardsiella tardaPada lempeng sisik dan PVC

Lempeng permukaan padat

dibentuk masing-masing seluas 1 cm2

dicuci dengan detergen selama 15 menit pada bak sonikator, kemudian dibilas dengan akuades

dimasukkan lempeng padat pada masing-masing botol digoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 30 oC selama rentang waktu 1, 3, 5 hari

dibilas 3 kali dengan aquadest steril sebanyak 10 mL untuk masing-masing jenis lempeng

Hasil

disterilkan dengan autoklaf 121o_C

dimasukkan media NB sebanyak 50 mL menumbuhkan hingga 108CFU/mL isolatE. tardadi dalam botol uji

dmasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0,9% dan 0,5 gr serbuk kaca (glass bead)

divortex selama 2 menituntukmelepas biofilm tersisa

dilakukan pengenceran berseri

dihitung jumlah koloni yang tumbuh

dari setiap pengenceran disebar 1 mL pada media PCA diinkubasi pada suhu 30o_C

Lampiran 8. Foto Penelitian

Glass bead(Manik-manik kaca) Lempeng plastik PVC