Pengujian aktivitas antimikroba BAL terhadap bakteri patogen dilakukan dengan metode difusi agar atau sumur Garriga, Hugas, Aymerich
dan Monfrot, 1993. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri Gram positif Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus dan
bakteri Gram negatif Escherichia coli dan Salmonella typhimurium. Kultur BAL diinokulasikan dalam media MRSB dan diinkubasi selama 24 jam.
Kultur bakteri uji disegarkan dalam media NA dan diinkubasi selama 24 jam. Kultur bakteri uji yang telah disegarkan diinokulasikan sebanyak ±10
6
bakteri ke dalam media NA. Selanjutnya 20 ml media agar NA yang telah terisi
kultur uji dituangkan ke cawan dan dibiarkan menjadi padat. Setelah memadat, dibuat sumur-sumur dengan diameter 6 mm, kemudian dimasukkan
60 µ
l kultur BAL dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari. Zona penghambatan adalah lebar areal bening yang terbentuk di sekitar sumur yang
dinyatakan dengan satuan mm. Cara perhitungan diameter penghambatan dapat dilihat pada Lampiran 2.
2. Seleksi Bakteri Asam Laktat yang Berpotensi Menghasilkan Bakteriosin
Tahap ini dibagi menjadi empat bagian, yaitu a Penentuan aktivitas antimikroba dengan metode kontak, b Penentuan kurva pertumbuhan BAL,
c Konfirmasi BAL penghasil bakteriosin, d Ekstraksi bakteriosin dan uji penghambatannya terhadap bakteri patogen.
a. Pengujian Aktivitas Antimikroba dengan Metode Kontak Fardiaz, 1989 dan
Rahayu, 2000
Isolat yang menunjukkan sifat penghambatan yang baik pada tahap pertama diujikan sifat penghambatannya terhadap Listeria monocytogenes
dengan metode kontak. Pada tahap ini digunakan supernatan yang dinetralkan dengan NaOH 1 N sampai pH 6.5 untuk mengeliminasi kemungkinan
penghambatan oleh asam. Sebagai perbandingan, dibuat juga supernatan yang tidak dinetralkan.
Kultur BAL diinokulasikan pada media MRSB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Selanjutnya kultur disentrifugasi pada 8000 rpm
4 C selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dibagi menjadi dua bagian,
yaitu untuk dinetralkan dan tidak dinetralkan masing-masing sebanyak 10 ml. Kemudian kedua bagian supernatan tersebut disaring dengan menggunakan
membran filter 0.22 µ
m.
Pengujian senyawa antimikroba dilakukan dengan metode uji kontak dengan menggunakan bakteri uji Listeria monocytogenes. Sebanyak 10 ml
supernatan yang dinetralkan dan tidak dinetralkan diinokulasikan dengan ±10
5
bakteri uji Listeria monocytogenes dan diinkubasi selama 8 jam pada suhu 37
C. Jumlah koloni Listeria monocytogenes dihitung pada jam ke-0 dan jam ke-8 inkubasi. Perhitungan jumlah koloni dilakukan berdasarkan
SPC Standard Plate Count dan dapat dilihat pada Lampiran 3. Apabila ada penghambatan terhadap Listeria monocytogenes, diduga
ada senyawa antimikroba yang dihasilkan selain asam, yaitu bakteriosin.
b. Penentuan Kurva Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat Rattanachaikunsopon
dan Phumkhachorn, 2006
Isolat BAL yang menunjukkan aktivitas bakteriosin diinokulasikan ke dalam MRSB sebanyak 2 . Kemudian dibaca nilai absorbansi atau OD Optical Density
dengan menggunakan spektofotometer UV visible setiap 1 atau 2 jam sekali sampai nilai absorbansi konstan yang menunjukkan pertumbuhan BAL telah mencapai fase
stasioner. Apabila pembacaan absorbansi di spektrofotometer menunjukkan nilai di atas 1, MRSB isolat BAL diencerkan dengan menggunakan MRSB steril dengan
faktor pengenceran tertentu. Perhitungan nilai OD dapat dilihat pada Lampiran 4.
c. Konfirmasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Bakteriosin
