16
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan pada bulan November 2011 sampai Maret 2012 bertempat di Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan IPB. Sampel kokon dan larva Attacus atlas berasal dari Perkebunan Teh Walini Panglejar Purwakarta Jawa Barat. Tahapan
penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Bagan alir penelitian.
Ekstraksi Protein Serisin
Pada penelitian ini protein serisin diekstraksi dari kelenjar sutera tengah dan kulit kokon. Kelenjar sutera tengah merupakan tempat sekresi protein serisin,
sedangkan kulit kokon adalah produk ulat sutera yang mengandung protein serisin dan fibroin. Protein serisin merupakan perekat serat-serat fibroin pada kokon.
A. Ekstraksi Protein Serisin dari Kelenjar Sutera Tengah Attacus atlas KSA
KSA adalah tempat protein serisin disekresi, sehingga hasil ekstraksi protein serisin dari KSA digunakan sebagai standar protein serisin Attacus atlas.
Protein serisin dari KSA digunakan sebagai pembanding dari crude protein serisin hasil ekstraksi dari kokon. Tahapan ekstraksi dari KSA sesuai Brasla Matei
1997 dan Invitrogen 2012 Lampiran 1. Hasil ekstraksi dianalisis bobot molekulnya dengan SDS PAGE Laemmli 1970.
Protein serisin Ulat sutera liar Attacus atlas dari
Perkebunan Teh Walini Purwakarta
Larva instar 6 Pembedahan untuk
mendapatkan kelenjar sutera tengah
Kokon Ekstraksi protein serisin
Crude protein serisin Karakterisasi:
- Kadar protein
- Asam amino
- Tegangan permukaan
- Bobot molekul
Ekstraksi protein serisin Serat sutera
fibroin Karakterisasi:
- Analisis serat
sutera fibroin
17
B. Ekstraksi Protein Serisin dari Kulit Kokon
B.1 Preparasi sampel kulit kokon Lampiran 2 sesuai dengan Solihin Fuah 2010 yang telah dimodifikasi.
B.2 Ekstraksi protein serisin dari kulit kokon Proses ekstraksi protein serisin dari kulit kokon terdiri dari dua tahap,
yaitu teknik degumming dan isolasi protein serisin. Degumming adalah proses penguraian serat sutera fibroin dari perekatnya gum atau serisin secara fisik
yaitu dengan suhu dan tekanan tinggi Padamwar Pawar 2004, serta secara kimia dengan NaOH 0,1 N Suriana 2011. Tujuan degumming adalah
menghasilkan serat sutera fibroin yang siap untuk dijadikan benang sutera dan mendapatkan serisin yang terlarut dalam larutan hasil degumming. Isolasi
protein serisin adalah tahapan mendapatkan protein target serisin dari larutan hasil degumming, dan pada penelitian ini targetnya berupa crude protein
serisin. Isolasi protein pada penelitian ini menggunakan teknik pengendapan dengan pelarut organik etanol 75 vv terhadap larutan hasil degumming
Wu et al. 2007. Proses ekstraksi dilakukan secara bertahap untuk mengetahui pengaruh
setiap kajian terhadap rendemen protein serisin yang dihasilkan. Setiap kajian sangat tergantung pada hasil kajian sebelumnya. Ada beberapa kajian yang
dilakukan, yaitu:
B.2.1 Kajian Pengaruh Rasio Volume NaOH 0,1 N dan Jenis Spesies Ulat Sutera terhadap Rendemen Protein Serisin
Ekstraksi protein serisin melalui teknik degumming secara fisik dan kimia Padamwar Pawar 2004, Suriana 2011 yang telah dimodifikasi.
Teknik degumming pada suhu 115
o
C selama 40 menit dan tekanan 700 mbar, serta variasi rasio NaOH 0,1 N 50 dan 33,3 terhadap distiled waterDW.
Isolasi protein dengan teknik pengendapan menggunakan etanol teknis 96 sebesar 75 vv terhadap larutan hasil degumming. Hasil isolasi berupa crude
protein serisin dalam bentuk cairan kental. Tahapan ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 2.
Rancangan percobaan yang digunakan dalam kajian ini adalah rancangan acak lengkap faktorial RALF dengan dua faktor yaitu rasio NaOH 0,1 N R
18
dan spesies ulat sutera S yang masing-masing pada dua taraf perlakuan yang diulang dua kali Tabel 4. Model matematikanya adalah:
Y
ijk
= µ + R
i
+ S
j
+ RS
ij
+ ε
ijk
Keterangan : Y
ijk
= Pengamatan berupa rendemen protein serisin pada perlakuan ke-i 1, 2 dan ke-j 1, 2 pada ulangan ke-k 1, 2
µ = Rataan umum
R
i
= Pengaruh rasio NaOH 0,1 N ke-i 1, 2 S
j
= Pengaruh spesies ulat sutera ke-j 1, 2 ε
ijk
= Pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan ke-j pada ulangan ke-k. Analisis RALF menggunakan program Minitab 14 Mattjik Sumertajaya
2002. Tabel 4 Tabulasi data kajian pengaruh rasio NaOH 0,1 N dan jenis spesies ulat
sutera terhadap rendemen protein serisin
Spesies Perlakuan
Total perlakuan
Rasio NaOH 50 R
1
Rasio NaOH 33,3 R
2
Attacus atlas S
1
Y
11
Y
21
Y
.1
= Y
.S1
Bombyx mori S
2
Y
12
Y
22
Y
.2
= Y
.S2
Total perlakuan
Y
1.
= Y
R1.
Y
2
= Y
R2.
Y…
B.2.2 Kajian Pengaruh Konsentrasi NaOH terhadap Rendemen Protein Serisin
Ekstraksi protein serisin melalui degumming secara fisik dan kimia Lampiran 2 pada suhu 115
o
C selama 40 menit dan tekanan 700 mbar, serta variasi konsentrasi NaOH 0,05 N; 0,1 N; 0,15 N; 0,20 N; 0,25 N dan 0,30 N
pada rasio volume 33,3 terhadap DW. Isolasi protein dengan etanol teknis 96 pada perbandingan volume 75 vv terhadap larutan hasil degumming.
Hasil isolasi protein berupa crude protein serisin. Rancangan percobaan yang digunakan dalam kajian ini adalah rancangan
acak lengkap RAL satu faktor konsentrasi NaOH dengan dua kali ulangan Tabel 5. Model matematikanya adalah:
Y
ij
= µ + N
i
+ ε
ij
19
Keterangan: Y
ij
= Pengamatan berupa rendemen protein serisin pada perlakuan ke-i 1, 2, 3, 4, 5, 6 dan ulangan ke-j 1, 2
µ = Rataan umum
N
i
= Pengaruh konsentrasi NaOH ke-i 1, 2, 3, 4, 5, 6 ε
ij
= Pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j. Jika hasil analisis ragam berpengaruh nyata maka akan dilakukan uji lanjut
dengan Tukey. Analisis RAL dan Tukey menggunakan program Minitab 14 Mattjik Sumertajaya 2002.
Tabel 5 Tabulasi data kajian pengaruh variasi konsentrasi NaOH terhadap rendemen protein serisin Attacus atlas
Ulangan Perlakuan
Total NaOH
0,05 N
N
1
NaOH 0,10 N
N
2
NaOH 0,15 N
N
3
NaOH 0,20 N
N
4
NaOH 0,25 N
N
5
NaOH 0,30 N
N
6
1 Y
11
Y
21
Y
31
Y
41
Y
51
Y
61
2 Y
12
Y
22
Y
32
Y
42
Y
52
Y
62
Total Y
1
= N
1
Y
2
= N
2
Y
3
= N
3
Y
4
= N
4
Y
5
= N
5
Y
6
= N
6
Y
N
=N
B.2.3 Kajian Pengaruh Kemurnian Etanol terhadap Rendemen Protein Serisin
Pada kajian ini menggunakan proses ekstraksi dengan teknik degumming secara fisik pada suhu 105
o
C selama 30 menit, dan tekanan 200 mbar. Isolasi protein menggunakan teknik pengendapan dengan etanol absolut dan teknis
96 masing-masing perbandingan volume terhadap larutan hasil degumming sebesar 75 vv. Hasil akhir isolasi berupa crude protein serisin dalam bentuk
cairan kental. Tahapan ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 2. Rancangan percobaan yang digunakan dalam kajian ini adalah rancangan
acak lengkap RAL satu faktor kemurnian etanol dengan tiga kali ulangan Tabel 6. Model matematikanya adalah:
Y
ij
= µ + E
i
+ ε
ij
Keterangan : Y
ij
= Pengamatan berupa rendemen protein serisin pada perlakuan ke-i 1, 2 dan ulangan ke-j 1, 2, 3
20
µ = Rataan umum
E
i
= Pengaruh kemurnian etanol ke-i ε
ij
= Pengaruh acak pada kemurnian etanol ke-i dan ulangan ke-j. Analisis RAL menggunakan program Minitab 14 Mattjik Sumertajaya
2002. Tabel 6 Tabulasi data kajian pengaruh kemurnian etanol terhadap rendemen
protein serisin Attacus atlas
Ulangan Perlakuan
Total Etanol absolut E
1
Etanol teknis 96 E
2
1 Y
11
Y
21
2 Y
12
Y
22
3
Y
13
Y
23
Total Y
1
= E
1
Y
E2
= E
2
Y
E
= E
B.2.4 Kajian Optimasi Rendemen Protein Serisin
Kajian optimasi rendemen protein serisin perlu dilakukan untuk mengetahui rendemen protein serisin yang maksimal dari kokon Attacus atlas.
Rendemen protein yang maksimal dapat disebabkan oleh teknik ekstraksi yang dilakukan atau kandungan protein serisin dalam kokon Attacus atlas. Ada tiga
perlakuan ekstraksi protein serisin yang dikerjakan pada kajian optimasi ini, yaitu:
- Optimasi 1 O
1
menggunakan teknik degumming fisik dan kimia pada kombinasi suhu dan waktu Tabel 7 serta 33,3 NaOH 0,25 N. Isolasi
protein dengan etanol teknis 96. -
Optimasi 2 O
2
menggunakan teknik degumming fisik dan kimia pada kombinasi suhu dan waktu Tabel 7 serta 33,3 NaOH 0,25 N. Isolasi
protein tanpa menggunakan etanol. -
Optimasi 3 O
3
menggunakan teknik degumming fisik pada kombinasi suhu dan waktu Tabel 7. Isolasi protein dengan etanol teknis 96.
Analisis yang digunakan dalam optimasi rendemen protein serisin adalah Response Surface Methodology RSM yang diolah dengan Program-R 2.11.1
Lenth 2010. Hubungan antara respon dan variabel bebas adalah: Y = fX
1
, X
2
,...., X
k
+ ε
21
Keterangan: Y
= Respon rendemen protein serisin X
i
= Variabel bebas i = 1, 2, 3,...., k ε
= error. Daerah optimum ordo pertama ditentukan dari percobaan sebelumnya
sehingga analisis ordo pertama tidak dilakukan lagi. Analisis ordo kedua titik optimum menggunakan model polinomial ordo kedua dengan fungsinya
kuadratik:
j i
j i
ij k
i ii
k i
i i
X X
X X
Y
i
1 2
1
Keterangan: Y = respon rendemen protein serisin
β
o
= konstanta
i,
ii,
ij
= koefesien dari variabel bebas X k = jumlah faktor yang digunakan.
Rancangan percobaan pada penelitian ini menggunakan Central Composite Design CCD seperti pada Tabel 7. Percobaan menggunakan dua
faktor 2
k
yaitu suhu X
1
dan waktu X
2
sehingga α = 1,414. Titik pusat yang digunakan adalah suhu 115
o
C dan waktu 40 menit. Tabel 7 Desain rancangan percobaan dengan Central Composite Design CCD
Variabel Kode Variabel Asli
X
1
X
2
Suhu
o
C Waktu menit
-1 -1
110 30
-1 1
110 50
1 -1
120 30
1 1
120 50
115 40
115 40
115 40
115 40
115 40
-1,414 107,93
40 1.414
122,07 40
-1,414 115
25,86 1.414
115 54,14
22
B.3 Analisis Protein Pada penelitian ini metode Lowry Apriyantono et al. 1989 digunakan
untuk menganalisis crude protein serisin dan deteksi absorbansinya menggunakan spektrofotometer tipe Gene Quant 1300 pada panjang
gelombang 750 nm. Crude protein serisin dihomogenisasi terlebih dahulu dengan stirrer sebelum dianalisis dengan Lowry. Hasil analisis berupa kadar
protein serisin mgml digunakan untuk menghitung rendemen protein serisin. Rendemen protein serisin dihitung dengan rumus:
Rendemen = [ Bobot protein dalam crude protein serisin ] x 100 [Bobot kulit kokon]
Khusus untuk perhitungan rendemen protein serisin pada kajian optimasi, ada dua perhitungan yang dilakukan yaitu tanpa penambahan air dalam fibroin
basah AFB dan dengan penambahan AFB. AFB adalah larutan hasil degumming yang terikut dalam fibroin karena proses pemisahan antara larutan
dan fibroin belum sempurna. Penambahan AFB dalam perhitungan digunakan untuk meminimalkan larutan yang terbuang karena keterbatasan kemampuan
alat pemisah. Tanpa penambahan AFB dinotasikan sebagai perlakuan 1, sedangkan dengan penambahan AFB dinotasikan sebagai perlakuan 2 sehingga
masing-masing perlakuan optimasi terdiri dari dua perhitungan dengan notasi O
11
, O
12
, O
21
, O
22
, O
31
dan O
32
. AFB dihitung dengan analisis kadar air fibroin untuk menghitung volume
larutan hasil degumming yang terikut dalam fibroin. Analisis kadar air menggunakan oven Selecta Digitheat
pada suhu 115
o
C selama 18 jam Apriyantono et al. 1989. Perhitungan kadar air fibroin hasil degumming
adalah:
AFB ml = [Bobot basah fibroin – Bobot kering fibroin x BJ larutan]
Keterangan: Berat jenis BJ larutan = 0,9889.
B.4 Analisis Fibroin Analisis fibroin dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstraksi terhadap
penampang fibroin hasil degumming. Pengamatan fibroin menggunakan mikroskop Optika Micro Image Analysis Versi 1.0 dengan pembesaran 400 kali
dan 1000 kali.
23
C. Karakterisasi Crude Protein Serisin
