Isolasi Minyak Atsiri Bunga Tembelekan dengan Alat destilasi Stahl Penentuan Kadar Minyak Atsiri Hasil Analisa dengan GC-MS

Fortex Fisions Whirch Mixer

3.2 Bahan-bahan

Bunga tembelekan Na 2 SO 4 Etanol 96 anhidrous p.a . Merck Alkohol 70 Nutrient Agar NA p.a Oxoid Nutrient Broth NB p.a Oxoid Mueller Hinton Agar MHA p.a Oxoid Larutan standar Mcfarland Aquadest Dimetil Sulfoksida DMSO Basillus subtilis Propionibacterium acne Eschechia coli Pseudomonas aeruginosa 3.3. Prosedur Penelitian 3.3.1. Penyediaan Sampel Sampel yang diteliti adalah bunga tembelekan Lantana camara L berwarna jingga. Bunga tembelekan dipisahkan dari tangkai bunga kemudian ditimbang.

3.3.2 Isolasi Minyak Atsiri Bunga Tembelekan dengan Alat destilasi Stahl

Sebanyak 200 g bunga tembelekan dimasukkan labu destilasi 1000 mL ditambahkan air suling 150 mL, dipasang pada alat penyuling Stahl dan dipanaskan selama ± 4-5 jam diatas penangas minyak hingga minyak atsiri menguap sempurna ditandai dengan keluarnya destilat yang jernih. Destilat yang Universitas Sumatera Utara diperoleh merupakan campuran minyak dengan air yang selanjutnya ditambahkan NaCl hingga jenuh, kemudian minyak atsiri yang masih tercampur dengan air diekstraksi dengan eter.Ekstrak eter yang masih tercampur dengan minyak atsiri ditambahkan Na 2 SO 4 anhidrous, kemudian disaring, filtrat hasil saringan diuapkan hingga diperoleh minyak atsiri sebagai residu yang selanjutnya disimpan dilemari pendingin pada suhu 4 °C. Minyak yang diperoleh dianalisa kandungan kimianya menggunakan alat GC-MS dan diuji aktivitas antibakteri terhadap Basillus subtilis, Propionibacterium acnes, Eschechia coli dan Pseudomonas aeruginosa dengan metode difusi agar Supriyanto dan Cahyono, 2012.

3.3.3 Analisis Minyak Atsiri Bunga Tembelekan dengan GC-MS

Cuplikan dimasukkan kedalam gerbang suntik pada sebuah alat GC-MS. Selanjutnya kondisi disesuaikan dengan kondisi dibawah ini kemudian diamati kromatogram yang dihasilkan oleh rekorder dan mass recorder serta mass spektra masing-masing senyawa. Kondisi alat GC-MS yaitu : Kolom : AGILENT HP 5MS Panjang : 30 meter Gas Pembawa : Helium Pengion : EI GC-2010 Temperatur kolom oven : 70 °C Suhu Injeksi : 310 °C Model Injeksi : Split Model aliran control : Pressure Tekanan : 13.7 kPa Total Aliran : 60 mLmin Aliran kolom : 0.50 mLmin Kecepatan Linear : 25.9 cmsec Aliran Pembersih : 3.0 mLmin Pembagian Pemecah : 113 Universitas Sumatera Utara Waktu Kesetimbangan : 1.0 min GCMS-QP2010 Suhu sumber Ion : 250 °C Suhu Interface : 305 °C Waktu Pemecah Pelarut : 2.80 min Detektor Gain Mode : Relative Detektor Gain : 0,00 kV MS Waktu Mulai : 3.00 min Waktu Berhenti : 80 min ACQ Mode : Scan Event Time : 0.50 sec Kecepatan Scan : 1250 Mulai mz : 28 Berhenti mz : 600 3.3.4 Pengujian Sifat Antibakteri Minyak Atsiri Bunga Tembelekan 3.3.4.1 Pembuatan Media Nutrient Agar NA Sebanyak 7 gram nutrient agar dimasukkan dalam Erlenmeyer lalu dilarutkan dengan 250 mL dan dipanaskan hingga semua larut. Kemudian disterilkan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit.

3.3.4.2 Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri

Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 mL media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut 30-45 °. Biakan bakteri Basilus subtilis dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi pada suhu 35 ± 2 °C selama 18-24 jam. Hal yang sama juga dilakukan pada biakan bakteri Propionibacterium acnes, Escherchia coli dan Pseudomonas aeruginosa. Universitas Sumatera Utara

3.3.4.3 Pembuatan Media Mueller Hinton agar MHA

Dimasukan 9.5 g serbuk Mueller Hinton Agar diamsukkan dalam Erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 250 mL aquades dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit.

3.3.4.4 Penyiapan Inokulum Bakteri

Sebanyak 3.25 g nutrient broth dilarutkan dengan 250 mL aquades dalam Erlenmeyer dan dipanaskan hingga semua larut, kemudian disterilkan di autoklaf 121 °C selama 15 menit dan didinginkan. Lalu koloni bakteri Basillus subtilis diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 mL media nutrient broth steril dalam tabung reaksi dan diinkubasikan pada suhu 35±2 °C selama ± 3 jam, lalu dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan standar Mcfarland. Hal yang sama juga dilakukan untuk koloni bakteri Propionibacterium acnes, Escherchia coli dan Pseudomonas aeruginosa.

3.3.4.5 Pembuatan Variasi Konsentrasi Minyak Atsiri Bunga Tembelekan Lantana camara L

Minyak atsiri bunga tembelekan dibuat dalam konsentrasi 10 dan 20 vv, dengan memipet 0.5 mL dan 1 mL minyak atsiri dengan menggunakan mat pipet dan dimasukkan kedalam labu ukur 5 mL, kemudian ditambahkan Dimetil Sulfoksida DMSO pada masing-masing minyak atsiri hingga garis batas dan dihomogenkan.

3.3.4.6 Uji Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri Bunga Tembelekan

Sebanyak 0,1 mL inokulum Basilus subtilis dimasukkan ke dalam cawan petri, setelah itu dituang media Mueller Hinton Agar sebanyak 15 mL dengan suhu 45-50 °C dihomogenkan sampai media bakteri tercampur rata, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan kertas cakram yang telah Universitas Sumatera Utara direndam dengan minyak atsiri bunga tembelekan dengan berbagai konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35±2 °C selama 18-24 jam. Selanjutnya diukur diameter daerah hambat di sekitar larutan penguji dengan jangka sorong. Dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri Propionibacterium acnes, Escherchia coli dan Pseudomonas aeruginosa Hatijah 2013. Universitas Sumatera Utara 3.4 Bagan Penelitian 3.4.1 Isolasi Minyak Atsiri Bunga Tembelekan dengan Alat Stahl dimasukkan kedalam labu Stahl 1Liter ditambahkan air suling 150 mL dirangkai alat Stahl dipanaskan hingga keluar uap air bersama minyak dimasukkan kedalam gelas erlenmeyer ditambahkan NaCl jenuh diekstraksi dengan eter dalam corong pemisah ditambahkan Na 2 SO 4 anhidrous disaring diuapkan pasa suhu 40º C 200 g Bunga Tembelekan Segar Destilat Lapisan atas Lapisan Residu Filtrat Minyak atsiri Analisa GC-MS Uji Antibakteri Universitas Sumatera Utara 3.4.2 Pengujian Sifat Antibakteri Minyak Atsiri Bunga Tembelekan 3.4.2.1 Pembuatan Media Nutrien Agar NA Miring dan Stok Kulkur Bakteri Dilarutkan dengan 250 mL aquadest dalam Erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit Dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 mL Dibiarkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut 30 °-45°C Diambil biakan bakteri Basillus subtilis dari strain utama dengan jarum ose lalu digoreskan pada Media NA yang telah memadat Diinkubasi pada suhu 35 °C selama 18-24 jam Dilakukan hal yang sama untuk bakteri Propionibacterium acne, Escherchia coli dan Pseudomonas aeruginosa. 7 g Media NA Media NA Steril Stok kultur Bakteri Basillus subtilis Universitas Sumatera Utara

3.4.2.2 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar MHA

Dilarutkan dengan 250 mL aquadest dalam erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit 9.5 g Media Mueller Hionton Agar MHA Media MHA Steril Universitas Sumatera Utara

3.4.2.3 Penyiapan Inokulum Bakteri

Dialrutkan dengan 250 mL aquadest dalam erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit Dimasukkan sebanyak 10 mL kedalam tabung reaksi Diambil koloni bakteri Basillus subtilis dari stok kultur bakteri dengan jarum ose Disuspensikan kedalam media Nutrient Broth NB Diinokulasi pada suhu 35 °C selama 3 jam Dibandingkan kekeruhannya dengan standar Mcfarland BaCl 2 : H 2 SO 4 Dilakukan hal yang sama untuk Propionibacterium acne, Escherchia coli dan Pseudomonas aeruginosa. 3.25 g Media Nutrien Broth NB Media NB Steril Inokulum bakteri Basillus subtilis Universitas Sumatera Utara

3.4.2.4 Uji Aktivitas Antibakteri

Dimasukkan kedalam cawan petri Ditambahkan 15 mL MHA dengan suhu 45 °C-50°C Dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata Dibiarkan sampai media memadat Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan minyak atsiri bunga tembelekan kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri Diinkubasi pada suhu 35 °C selama 1-24 jam dalm inkubator Diukur diameter zona bening disekitar cakram dengan jangka sorong Dilakukan hal yang sama untuk Propionibacterium acnes, Escherchia coli dan Pseudomonas aeruginosa. 0.1 mL inokulum bakteri Basillus subtilis Hasil Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

4.1.1 Penentuan Kadar Minyak Atsiri

Minyak Atsiri bunga tembelekan berwarna jingga diperoleh dengan metode hidrodestilasi menggunakan alat Stahl. Proses ini dilakukan secara triplo. Hasilnya seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.1. Tabel 4.1 Minyak Atsiri bunga tembelekan yang diperoleh dengan metode hidrodestilasi Berat Sampel HasilmL Rata-rata Berat Minyak Atsiri g I II II mL gr 200 0,13 0,12 0,10 0,11 0,0932

4.1.2 Hasil Analisa dengan GC-MS

Minyak atsiri yang dihasilkan secara hidrodestilasi dianalisa dengan Gas Chromatography-Mass Spectroscopy GS-MS. Kromatogram Kromatografi Gas dari bunga tembelekan hasil hidrodestilasi diperoleh 72 puncak senyawa gambar 4.1 dan masing-masing senyawa dari hasil interpretasi yang dapat diindentifikasi berdasarkan standart library sebanyak 13 senyawa seperti pada tabel 4.2. Universitas Sumatera Utara Gambar 4.1. Kromatogram hasil analisa Kromatografi Gas minyak atsiri bunga tembelekan Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara Tabel 4.2. Senyawa Hasil Analisa GC-MS Minyak Atsiri Bunga Tembelekan No. Waktu Massa Rumus Nama Senyawa Peak Retensi Senyawa Molekul yang diduga Kadar menit 7 7.974 136 C 10 H 16 12 9.645 134 C ß- Ocimene 0.54 10 H 14 14 9.872 154 C p-Cymene 1.79 10 H 18 20 20.944 204 C O 1,8 Sineol 1.59 15 H 24 23 22.317 204 C α-Kopaen 1.12 15 H 24 25 22.521 204 C Kariofilen 10.87 15 H 24 29 23.226 204 C Kalaren 2.42 15 H 24 32 23.852 202 C α-Humulen 7.59 15 H 22 33 23.933 204 C α-Kurkumin 3.53 15 H 24 36 24.346 204 C Germakren-D 3.09 15 H 24 38 24.935 204 C α-Murolen 2.27 15 H 24 40 25.861 204 C Delta Kadinen 1.59 15 H 26 42 26.527 236 C O Nerolidol-B 1.00 15 H 24 O 2 Davanone 9.84

4.1.3. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri