ANTIOKSIDAN 1. Mekanisme oksidasi lemak

15 Komponen yang berperan pada pencoklatan kecap terbagi menjadi dua yaitu fraksi kation dan fraksi gabungan antara anion dengan fraksi netral. Fraksi anion terdiri dari asam amino, abu dan senyawa yang belum diketahui. Hanya fraksi kation yang bertambah gelap selama penyimpanan dengan adanya sedikit gula. Pembentukan warna merupakan proses yang kompleks, diduga dipengaruhi oleh faktor seperti gula, karbonil, komponen Amadori, redukton, asam organik, besi, tembaga, sodium klorida, total nitrogen, peptida dan asam amino. Senyawa redukton, komponen karbonil dan 3-DG deoksiglukoson dilaporkan mempunyai peranan penting dalam reaksi pencoklatan. Redukton diperoleh dari fraksi kation dalam jumlah sedikit dan dapat dielusi dengan HCl, sehingga fraksi kation yang mengandung redukton warnanya gelap Hashiba 1978. D. ANTIOKSIDAN D.1. Mekanisme oksidasi lemak Oksidasi lemak berjalan dengan dua tahap: 1 disebut sebagai periode induksi, selama tahap ini oksidasi berjalan lambat dengan laju kecepatan seragam, 2 Laju oksidasi pada tahap kedua beberapa kali lebih cepat dari tahap pertama. Umumnya lemak dan minyak mulai terasa tengik pada awal tahap kedua. Asam linoleat yang memiliki ikatan rangkap lebih banyak bereaksi lebih cepat dibanding metil oleat akibatnya periode induksinya lebih pendek Meyer 1973 Hamilton 1983. Mekanisme oksidasi lipid tidak jenuh diawali dengan tahap inisiasi, yaitu terbentuknya radikal bebas R bila lipida kontak dengan panas, cahaya, ion metal dan oksigen. Reaksi ini terjadi pada grup metilen yang berdekatan dengan ikatan rangkap –C=C- Smith 1991. Tahap selanjutnya adalah tahap propagasi dimana autooksidasi berawal ketika radikal lipida R hasil inisiasi bertemu dengan oksigen membentuk radikal peroksida ROO. Reaksi oksigenasi ini terjadi sangat cepat dengan energi aktivasi hampir nol sehingga konsentrasi ROO yang terbentuk jauh lebih besar dari konsentrasi R dalam sistem makanan dimana oksigen berada. Radikal peroksida yang terbentuk akan mengekstrak ion hidrogen dari molekul lipida lain R1H membentuk hidroperoksida ROOH dan molekul radikal lipida baru R1. Selanjutnya reaksi autooksidasi ini akan berulang sehingga merupakan reaksi berantai Gordon 1990. Tahap terakhir oksidasi lipida adalah 16 tahap terminasi, dimana hidroperoksida yang sangat tidak stabil terpecah menjadi senyawa organik berantai pendek seperti aldehid, keton, alkohol dan asam Gambar 2.4. Inisiasi : ROOH ROO . + H . ROOH RO . + .. OH 2ROOH RO . + H 2 O + ROO . Propagasi : R . + O 2 ROO . ROO . + R 1 H ROOH + R 1 Terminasi : ROO . + R 1 OO ROOR 1 + O 2 RO. + R 1 ROR’ Gambar 2.4. Mekanisme autooksidasi Gordon 1990 Menurut Sherwin 1990 terbentuknya radikal diawali dengan oksidasi pada ikatan rangkap dan karbon-- α dalam molekul trigliserida. Tahap inisiasi hidrogen dihilangkan dari karbon- α . Hal ini dikatalisis oleh panas, sinar dan logam. Bentuk yang tidak stabil dari trigliserida ini sangat reaktif dengan oksigen sehingga mudah membentuk senyawa organik dengan rantai pendek. Pada akhirnya gliserida tersebut mengalami ketengikan dalam pangan. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Gambar 2. 5. Faktor-faktor dan kondisi yang dapat ikut berperan pada oksidasi lipida adalah a panas, setiap peningkatan suhu sebesar 10 o C laju kecepatan meningkat dua kali, b cahaya, terutama ultraviolet yang merupakan inisiator dan katalisator kuat, c logam, logam terlarut seperti Fe, Cu merupakan katalisator kuat meski dalam jumlah kecil, d kondisi alkali, ion alkali merangsang radikal bebas, e tingkat ketidakjenuhan, jumlah dan posisi ikatan rangkap pada molekul lipida berhubungan langsung dengan kerentanan terhadap oksidasi contoh, asam linolenat lebih rentan dibandingkan asam oleat, dan f ketesediaan oksigen Smith 1991. D.2. Reaksi Antioksidasi Antioksidan merupakan senyawa yang dapat memperlambat oksidasi di dalam bahan. Antioksidan harus mampu menunda atau mencegah terjadinya reaksi autooksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipida Kochhar Rossell 17 1990. Untuk itu antioksidan harus mempunyai sifat: efektif pada konsentrasi rendah, aman, tidak memberi warna, odor atau flavor, tahan setelah pengolahan, stabil dalam produk akhir, larut dalam lemak, tersedia dengan harga yang relatif H O H H H Ikatan rangkap dan karbon- α H-C-O-CCH 2 6 - C-C=C - CH 2 2 CH 3 pada molekul trigliserida O H merupakan tempat oksidasi H-C-O-C-R O -H + tahap inisiasi, hidrogen lepas H-C-O-C-R dari karbon- α asam lemak H dikatalisis panas,cahaya,logam Radikal lipida bentuk tidak stabil dari gliserida Sangat reaktif dengan oksigen +O 2 radikal peroksida sangat tidak stabil, terdekomposisi +hidroperoksida ke senyawa organik rantai pendek Produk akhir oksidasi gliserida aldehid, asam, keton, alkohol penyebab tengik Gambar 2.5. Reaksi ketengikan oksidatif pada lipida Sherwin 1990 rendah dan kelihatan “natural” pada kemasan Cuppett et al 1996. Antioksidan dapat berperan sebagai inhibitor atau pemecah peroksida. a. Inhibitor Reaksi autoksidasi dalam cairan atau fase larutan berlangsung melalui proses pembentukan radikal. Permulaan reaksi memerlukan produksi radikal bebas baik oleh serangan oksigen langsung, reaksi fotokimia atau oleh agensia yang ditambahkan. Reaksi ini meliputi inisiasi, propagasi dan terminasi Gambar 2.4. Antioksidan bereaksi dengan rantai pembawa radikal bebas membentuk produk inert dalam satu fase terminasi. 18 Jumlah rantai reaksi yang paling mungkin dihentikan oleh satu molekul inhibitor adalah dua. Oleh karena itu reaksi antara suatu inhibitor dengan sebuah radikal peroksi berlangsung melalui dua tahap: ROO + AH2 ROOH + AH AH + AH A + AH2 • AH : antioksidan Mekanisme lain melalui pembentukan kompleks antara radikal peroksi dan inhibitor. Kompleks ini kemudian bereaksi dengan radikal peroksi lain menghasilkan produk terminasi. Fase ini yang menentukan kecepatan reaksi. ROO + AH ROO AH ROO AH + AH produk terminasi Pada umumnya antioksidan dapat menghentikan rantai reaksi oksidatif sebagai berikut : 1 dengan donasi elektron pada radikal peroksi; 2 dengan donasi atom hidrogen pada radikal peroksi; 3 dengan adisi pada radikal peroksi sebelum atau sesudah terjadi oksidasi parsial, dan 4 dengan metode lain yang mungkin berkaitan dengan radikal hidrokarbon b.Pemecah peroksida Mekanisme ini meliputi dekomposisi katalitik hidroperoksida yang mula-mula terdapat dalam sistem, atau mungkin terbentuk sebagai akibat serangan langsung oksigen pada substrat atau pada inhibitor. Hasil stabil primernya bukanlah radikal bebas. Dekomposisi dapat berlangsung dengan proses stoikhiometrik, dengan proses yang menghasilkan radikal bebas dan dalam beberapa hal dengan pengaturan ionik. Beberapa senyawa sulfur adalah pemecah peroksida yang efektif. Peranan ini dapat berupa reaksi transfer satu elektron, dan struktur permulaannya mungkin hanya prekursor inhibitor aktif Smith 1991. Berdasarkan fungsinya antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan primer dan sekunder. Antioksidan primer akan memecah rantai dan mendonorkan atom hidrogennya ke radikal lipida RO dan radikal turunannya 19 A sehingga menjadi stabil. Antioksidan sekunder dapat memperlambat laju reaksi autooksidasi. Mekanisme kerjanya seperti: mengikat ion metal, menangkap oksigen, memecah hidroperoksida menjadi non radikal, menyerap radiasi ultra violet atau mendeaktifkan oksigen singlet Gordon 1990. Berdasarkan sumbernya, antioksidan dibagi dalam dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik BHA, BHT, TBHQ, propil gallat, dll dan antioksidan alami tocopherol, karoten , flavonoid, diterpen, senyawa produk reaksi Maillard, dll. Peranan antioksidan sintetis semakin menurun digantikan posisinya oleh antioksidan alami karena adanya kekhawatiran penyebab kanker. Ada beberapa senyawa fenolik pada kedelai yang memiliki aktivitas antioksidan, salah satunya adalah flavonoid. Flavonoid kedelai unik karena dari semua flavonoid yang teridentifikasi adalah isoflavon. Senyawa antioksidan alami isoflavon kedelai adalah 5,7,5’-trihidroksiisoflavon-7-O-monoglukosida geninstein , 7,4’-dihidroksiisoflavon-7-O-monoglukosida daidzein , dan 7,4’- dihidroksi-6-metoksi-isoflavon-7-O-monoglukosida glycitein . Isoflavon yang terdapat pada produk kedelai yang difermentasi yaitu 6,7,4’-trihidroksiisoflavon Pratt 1992. Selain isoflavon, kedelai dan produk-produk kedelai merupakan sumber berbagai macam senyawa antioksidan yang merupakan golongan dari turunan asam sinamat, fosfolipida, tokoferol, asam amino dan peptida Shahidi Naczk 1995 D.3 Antioksidan dalam Produk Reaksi Maillard Antioksidan dikelompokkan ke dalam dua kategori: menangkap radikal bebas dan mengkelat logammetal Lu Baker 1986. Efek menangkap radikal dari ovalbumin semakin meningkat dengan adanya konyugasinya dengan dekstran atau galaktomanan melalui reaksi Maillard antara gugus amino bebas dalam protein dan gugus karbonil pereduksi dalam polisakarida Nakamura et al. 1992. Antioksidan dibentuk pada beberapa level selama pemanasan karbonil- amina, termasuk degradasi senyawa Amadori menjadi amino redukton atau pembentukan polimer dengan aktivitas antioksidan. Bailey Won Um 1992 dapat membuktikan bahwa reduktone dari MRP dapat menghambat oksidasi minyak sayur. Sebuah redukton dari 3-hidroksi-2-ketopropane yang terdiri senyawa dikarbonil vicinal berkemampuan pembentukan enolisasi atau enol dan membentuk gugus keto diikuti lepasnya atom H. Contohnya triosa redukton, asam dihidromalat, asam reduktat dan dihidro pirogalllol. 20 Redukton sebagai agen pereduksi organik mempunyai gugus fungsional yang berasal dari konyugasi enediol dan karbonil. Peneliti yang lain menunjukkan bahwa analog amino dimana gugus hidroksilnya digantikan oleh NH 2 atau gugus karbonilnya digantikan oleh gugus –C=NR menjadi agen pereduksi yang kuat. Menurut Bailey Won Um 1992, tiga jalan utama yang berperan pada pembentukan senyawa intermediat dalam antioksidan dan pembentukan pigmen dari senyawa Amadori, yaitu 1-deoksioson, 1-deoksiredukton dan 3-deoksioson. Jalur ke empat dari degradasi strecker. Pembentukan enol dari 1-deoksioson 1-deoksiredukton dengan degradasi menghasilkan piruvaldehid, diasetil, asetaldehid, asam asetat dan redukton. Senyawa-senyawa ini potensial sebagai prekursor antioksidan, khususnya ketika pemanasan amina. Amino redukton kemungkinan lebih efektif dan stabil dibandingkan dengan enediol. Redukton amino lebih baik sebagai antioksidan disebabkan nitrogennya menyumbangkan gugus elektrofilik yang mampu mengkelat ion metal seperti copper dan Fe yang diketahui mempunyai aktivitas katalitik. Gugus penting lainnya dari senyawa yang dibentuk oleh dehidrasi senyawa 2,3-enolisasi 2,3-osone yang diikuti rekondensasi dengan amina adalah amina redukton, yang kemungkinan mempunyai aktivitas sebagai antioksidan. Reaksi ini dapat berasal dari degradasi D-Fruktoseamine dalam larutan alkali Produk reaksi Maillard dengan perlakuan panas dari sistem model glukosa- glisin menghambat lebih dari 90 radikal OH. Mekanisme penghambatannya tidak hanya menangkap radikal OH secara langsung tetapi juga dengan menekan pembentukan radikal OH melalui pengkelatan dengan logam Fe 2+ reaksi Fenton. Kemampuan pengkelatan metal dari produk reaksi Maillard dengan berat molekul yang besar adalah lebih tinggi dibandingkan dengan yang mempunyai berat molekul kecil Yoshimura et al 1997. Pada Tabel 2.3 memperlihatkan banyak sistem model produk reaksi Maillard mempunyai aktivitas sebagai antioksidan. Pembentukan produk reaksi Maillard dari pemanasan campuran lisin dan madu memberikan efek antioksidan dalam sistem asam linoleat Antony et al. 2000. Kondisi-kondisi reaksi seperti pH, waktu dan suhu reaksi, perbandingan molar reaktan dan konsentrasinya, aktivitas air dan medium reaksi sangat mempengaruhi aktivitas antioksidan. Antioksidan dibentuk pada beberapa tahap selama reaksi Maillard, termasuk degradasi senyawa Amadori pada amino redukton, atau redukton, dan pembentukan polimer dengan aktivitas antioksidan 21 Tabel 2.3 .Deskripsi Sistem Model dan Pangan yang Mengalami Browning Non-Enzimatis dan Koefisien Statistik Aktivitas Antioksidan dengan Warna a. Dengan pengukuran polarografik konsumsi oksigen,gas kromatografi-head space atau deteksi bilangan peroksida b. Pengamatan spektroskopik penghambatan crocin bleaching c. Dengan Potasium Ferisianida Manzocco L et al. 2001 Sistem model variable Pengujian aktivitas antioksidan Pengukuran warna Korelasi Linear R 2 Probabilitas Jumlah n A.Glukosa-Histidin Dipanaskan 100 o C selama 5 jam B.Glukosa-Fruktosa-asam glutamat Dipanaskan 95 o C selama 50 jam C.Glukosa-lisin-pati pregelatinisasi Dipanaskan 100 o C selama 90 menit D.Glukosa-histidin PH 3;5;7;9;11 dan dipanaskan 100 o C Selama 5 jam E.Glukosa-asam amino cys,hys,val,lys, arg,dipanaskan 100 o C selama 5 jam F.Fruktosa-asam amino cys,hys,val,lys, Arg,dipanaskan 100 o C selama 5 jam G.Fraksi MRP dengan perbedaan BM dari glukosa-triptophan dipanaskan 100 o C selama 10 jam H.Sukrosa-lisin dengan perbedaan kons. Molar,dipanaskan 100 o C waktu 6jam I.Glukosa-glysine freeze dry pada a w 0.23-0.82 disimpan 40 o C waktu 40jam J.Pasta, dikeringkan 50 o C atau 110 o c K.Pure tomat, dipanaskan 95 o C sampai waktu 50 jam Waktu pemanasan Waktu pemanasan Waktu pemanasan pH awal Asam amino Asam amino Berat molekul Rasio reaktan Waktu pemanasan dan a w awal waktu pamanasan dan temperature waktu pemanasan Penghambatan oksidasi asam linoleat a Radikal quenching b Radikal quenching Penghambatan oksidasi asam linoleat Penghambatan oksidasi asam linoleat Penghambatan oksidasi asam linoleat Kekuatan reduksi c Penghambatan oksidasi asam linoleat Kekuatan reduksi Radikal quenching Radika quenching Absorban 450 nm Absorban 420 nm Parameter hunter Absorban 450 nm Absorban 450 nm Absorban 450 nm Absorban 420 nm Absorban 480 nm Absorban 420 nm Parameter hunter Absorban 420 nm 0.94 0.99 0.88 0.94 0.92 0.80 0.96 0.96 0.81 0.98 0.82 10 -5 10 -3 10 -3 10 -2 10 -2 10 -2 10 -3 10 -4 10 -3 10 -4 10 -2 10 7 7 5 5 5 6 7 9 7 6 Bailey Won Um 1992. Contoh yang lain aktivitas antioksidan produk reaksi Maillard juga berpengaruh terhadap stabilitas oksidasi pada margarin. Produk reaksi Maillard non volatil yang telah dilaporkan berfungsi sebagai antioksidan adalah produk reaksi Maillard berberat molekul tinggi melanoidin dan berberat molekul rendah Bailey Won Um 1992. Salah satu penelitian yang dilakukan oleh Schlüsselw rter 2001 menggunakan melanoidin standar yang ditambahkan pada minyak wijen dan efeknya dibandingkan dengan α - tokoferol dan sesamol, yaitu senyawa antioksidan yang terdapat pada minyak wijen. Hasilnya menunjukkan bahwa efek antioksidannya meningkat dengan semakin meningkatnya suhu pemanasan biji wijen. Dua mekanisme yang mungkin yang dapat menjelaskan sifat antioksidan melanoidin adalah pembentukan radikal bebas sebagai inhibitor dan pembentukan struktur reduktone enaminol. Struktur melanoidin mengindikasikan adanya tipe redukton yang berperan sebagai antioksidan mengkelat metal sebagaimana aktivitas reduksi. Hal ini menunjukkan struktur hidroksi piridone atau seperti piranone Gambar 2.6 dalam melanoidin yang mengkompleks besi Fe +++ dan mereduksi aktivitas katalitiknya. Struktur ini menyerupai maltol yang mengkelat besi Bailey Won Um 1992. Fe Fe HO O O OH H 3 C OH N N O O HO R OH H 3 C O Fe Gambar 2.6. Struktur Hidroksipiridone dan Piranone dari Melanoidin sebagai Sekuestran Logam Fe Bailey Won Um 1992 Enediol dan enaminol pada melanoidin mempunyai aktivitas pereduksi. Perubahan bentuk oksidasi-reduksi dari redukton melanoidin berpengaruh pada intensitas warna, pengkelat metal dan disosiasi gugus fungsional Tabel 2.4 . Tabel 2.4 .Efek oksidasi dan reduksi pada aktivitas pengkelat, intensitas warna dan berat molekul melanoidin Aktivitas Pengkelat Melanoidin berikatan Cu µ g Cumg melanoidin E 1 500nm BM peak positif peak negatif utuh 22.9 8.4 30.4 32000 teroksidasi 29.8 8.8 20.8 51000 terreduksi 9.1 2.3 19.0 41000 Homma S e t.al 1997 Melanoidin merupakan reduktone dan polimer amfoter. Pada proses pengolahan kecap, melanoidin mengalami oksidasi-reduksi. Enediol dan enaminol dalam melanoidin termasuk dalam aktivitas reduksi dan antioksidan. Perubahan dalam bentuk oksidasi-reduksi dari redukton dalam melanoidin mempengaruhi warna, aktivitas mengkelat metal dan disosiasi gugus fungsional.

E. Uji Aktivitas Antioksidan