Karakteristik Kimia Fraksi-Fraksi Produk M, MP, KGM dan KGP 1 Perubahan Kadar Protein

Hasil analisis antioksidan ke empat metode di atas menunjukkan terdapat perbedaan. Hasil dari metode rancimat mendekati hasil yang didapat pada metode tiosianat. Proses oksidasi pada lemak menghasilkan suatu peroksida dimana pada rancimat akan memberikan nilai konduktivitas yang akan memunculkan kurva oksidasi yang diperoleh dari perubahan waktu induksi, sedangkan dengan metode tiosianat, peroksida yang dihasilkan dari oksidasi asam lemak linoleat akan mengoksidasi Fe 2+ menjadi Fe 3+ . Hasil metode DPPH mendekati hasil dari metode TBA, meskipun tujuan penggunaan metode DPPH berbeda dengan metode TBA. Pengukuran aktivitas antioksidan dengan menggunakan DPPH untuk mengetahui kemampuan suatu komponen senyawa dalam menangkap radikal DPPH sehingga menjadi bentuk yang stabil, sedangkan pengukuran dengan TBA untuk mengetahui kemampuan suatu senyawa dalam menghambat pembentukan malonaldehid sehingga semakin besar nilai TBA menunjukkan kurang kuatnya suatu senyawa sebagai antioksidan. Perbedaan hasil yang didapat diduga kuat disebabkan oleh perbedaan penggunaan suhu pada saat analisis. Pada metode dengan rancimat menggunakan suhu 110 o C dan metode tiosianat 37 o C, sedangkan metode dengan DPPH dan TBA menggunakan suhu kamar. Alaiz et al 1995 mendapatkan hasil analisis aktivitas antioksidan dengan TBARS lebih baik daripada rancimat karena senyawa pirol yang dihasilkan oleh 4,5E-epoxy-2E- heptenal dengan lisin mengalami degradasi dengan rancimat. C. Karakteristik Kimia Fraksi-Fraksi Produk M, MP, KGM dan KGP C.1 Perubahan Kadar Protein Pada moromi M, moromi yang dipanaskan MP, KGM dan KGP, protein sebagian besar berada pada F4 berat molekul 10 kDa diikuti terdapat pada F3 BM 10 – 30 kDa. Kadar protein moromi terjadi perubahan ketika berubah bentuk menjadi produk kecap manis KGM dan KGP atau ketika moromi dipanaskan. Kadar protein pada produk moromi 3.68 mgml, setelah moromi dipanaskan MP kadarnya menjadi 3.21 mgml, dan ketika menjadi produk kecap manis KGM kadarnya sebesar 2.62 mgml dan KGP 2.89 mgml Lampiran 2. Pola penyebaran kadar protein pada masing-masing fraksi tiap produk dapat dilihat pada Gambar 4.10. Pada fraksi F4 Moromi M kadar protein terjadi perubahan ketika produk moromi dipanaskan selama 20 menit MP, dan ketika moromi dilakukan pemanasan lebih lama sampai 65 menit dan juga dengan penambahan gula KGM dan KGP. 0,022 0,07 0,02 0,05 0,05 0,02 0,04 0,04 1,12 1,11 1,09 1,21 2,37 1,99 1,44 1,54 0,5 1 1,5 2 2,5 3 M MP KGM KGP jenis produk K a d a r p ro te in m g m l F1 F2 F3 F4 Keterangan: M: moromi; MP: moromi dipanaskan; KGM: kecap manis dengan gula merah; KGP: kecap manis dengan gula pasir; F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F2: fraksi dengan berat molekul 30-100 kDa; F3: fraksi dengan berat molekul 10-30 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa Gambar 4.10 Kadar protein fraksi - fraksi pada tiap produk C.2 Perubahan Kadar Alfa-Amino Kadar alfa-amino produk M 2.99 mgml mengalami perubahan ketika berubah bentuknya menjadi produk MP 2.39 mgml, produk KGM 2.26 mgml dan produk KGP 2.29 mgml Lampiran 3. Kadar alfa-amino tiap produk banyak terdapat pada F4 Gambar 4.11. Hal ini menunjukkan berat molekul asam amino banyak berada pada kisaran berat molekul 10 kDa. Perubahan kadar alfa amino banyak disebabkan karena proses pemanasan dan penambahan gula pada proses pembuatan kecap manis. b c b c b b b b 0.04 0.13 0.02 0.05 0.08 0.03 0.02 0.02 0.17 0.26 0.30 0.87 2.67 1.94 1.90 1.33 -0.50 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 M MP KGM KGP jenis produk k a d a r a lf a -a m in o m g m l F1 F2 F3 F4 Keterangan: M: moromi; MP: moromi dipanaskan; KGM: kecap manis dengan gula merah; KGP: kecap manis dengan gula pasir; F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F2: fraksi dengan berat molekul 30-100 kDa; F3: fraksi dengan berat molekul 10-30 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa Gambar 4.11 Kadar alfa-amino fraksi – fraksi tiap produk Pereaksi TNBS bereaksi secara lambat dengan ion hidroksil. Kedua puluh asam amino penyusun protein mengandung ion hidroksil sebagai bagian dari gugus karboksil. Asam amino serin, treonin, asam aspartat dan asam glutamat juga mengandung gugus hidroksil tambahan pada rantai sampingnya. Oleh karena itu kadar α -amino tiap fraksi juga ditentukan oleh perbedaan konsentrasi ke empat asam amino tersebut. Semua asam amino bebas dapat berpartisipasi dalam reaksi Maillard disebabkan gugus amino bebasnya. Kebanyakan asam amino bahan pangan terdapat dalam suatu rangkaian peptida, dimana hanya pada gugus terminal dan rantai samping yang reaktif dari residu asam amino yang terlibat dalam reaksi Maillard Adler-Niesen 1979.. C.3 Perubahan Kadar Total Fenol Kadar fenol produk M 713.56 ppm, MP 799.12 ppm, KGM 572.78 ppm dan KGP 362.16 ppm Lampiran 6. Pada MP kadar fenol lebih besar daripada M, di duga karena adanya pemanasan fenol yang terikat dengan molekul lain akan terlepas dan pada saat analisis akan mudah terdeteksi. Pada masing-masing i h h g cd de e f produk fenol sebagian besar terdapat pada F4. Hal ini menunjukkan bahwa fenol berada pada kisaran berat molekul 10 kDa Gambar 4.12. Pada produk M, MP dan KGP, semakin besar berat molekul, kadar fenol semakin berkurang. Pada produk KGM, kadar fenol F1 lebih besar dibandingkan pada F2 dan F3. Hal ini diduga fenol pada KGM ada yang terikat pada molekul yang lebih besar. Secara keseluruhan, produk M memiliki kadar fenol paling besar dibandingkan produk yang lain. Diduga pada produk MP dan KGMKGP, fenol mengalami degradasi karena adanya pemanasan. Senyawa fenol pada M, MP, KGM dan KGP berasal dari kedelai yang digunakan sebagai bahan baku pembuatannya. Ada beberapa senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan yang terdapat pada kedelai Glycine max .L., salah satunya adalah flavonoid. Flavonoid kedelai unik dimana hampir semua flavonoidnya adalah isoflavon. Isoflavon dari kedelai berupa 5,7,5’ - trihidroksiisoflavon – 7 – O - monoglukosida genistein , 7,4’ - dihidroksiisoflavon – 7 – O - monoglukosida daidzein , dan 7,4’ – dihidroksi – 6 –metoksi – isoflavon – 7 – O - monoglukosida glycitein . Spesifik untuk kedelai yang difermentasi isoflavonnya berupa 6,7,4” – trihidroksiisoflavon Pratt 19992. 68.2 80.24 101.37 26.01 81.93 73.2 51.15 21.3 117.28 111.51 59.32 53.55 446.15 360.94 261.3 534.18 100 200 300 400 500 600 M MP KGM KGP jenis produk k a d a r fe n o l p p m F1 F2 F3 F4 Keterangan: M: moromi; MP: moromi dipanaskan; KGM: kecap manis dengan gula merah; KGP: kecap manis dengan gula pasir; F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F2: fraksi dengan berat molekul 30-100 kDa; F3: fraksi dengan berat molekul 10-30 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa Gambar 4.12 Kadar fenol fraksi – fraksi tiap produk h i g f bcd d e d cd e e b bc a a b Fenol bebas dan produk oksidasinya diketahui beinteraksi dengan protein bahan pangan dan menghambat aktivitas anzim-enzim seperti oksidase, tripsin, arginase dan lipase. Dengan demikian kadar fenol juga berhubungan dengan kadar protein Haslam et al 1992. C.4 Karakteristik Serapan UV-Vis tiap Fraksi dari tiap Produk Selama proses pengolahan perubahan warna ini terjadi secara simultan dan berkembang menjadi beberapa tipe pigmen dengan perbedaan komposisi senyawa kimia. Pengukuran absorbansi uv-vis pada kisaran panjang gelombang 200 - 500 nm dimaksudkan untuk melihat intensitas pigmen coklat. Warna dan kekeruhan fraksi menentukan spektrum uv-vis, juga ditentukan oleh kadar total padatan fraksi. Fraksi F4 untuk semua produk M, MP, KGM dan KGP memiliki kadar total padatan tertinggi jika dibandingkan dengan F1, F2 dan F3 Gambar 4.13. Diduga sebagian besar komponen-komponen dalam tiap produk M, MP, KGM dan KGP mempunyai berat molekul 10 kDa. Hal ini juga menghasilkan penampakan tiap fraksi yang berbeda, F1 dan F2 berwarna putih-kekuningan dan bening, F3 dan F4 berwarna coklat sampai coklat kehitaman Gambar 4.14. 5 10 15 20 25 30 M MP KGM KGP jenis produk k a d a r to ta l p a d a ta n F1 F2 F3 F4 Keterangan: M: moromi; MP: moromi dipanaskan; KGM: kecap manis dengan gula merah; KGP: kecap manis dengan gula pasir; F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F2: fraksi dengan berat molekul 30-100 kDa; F3: fraksi dengan berat molekul 10-30 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa Gambar 4.13 Kadar total padatan fraksi-fraksi pada tiap produk e d c c Total padatan dan pigmen coklat pada empat produk M, MP, KGM dan KGP menghasilkan semakin besar berat molekul dari fraksi, total padatan dan pigmen coklat semakin berkurang. Fraksi dengan berat molekul 30 kDa F1 dan F2 berwarna kuning – kuning bening. Fraksi dengan berat molekul 30 kDa F3 dan F4 berwarna coklat muda – coklat kehitaman. Penampakan tiap fraksi dari penelitian ini menghasilkan intensitas pencoklatan yang selaras dari hasil penelitian Hofmann 1998 yang ditampilkan pada Tabel 4.5. Pada fraksi dengan berat molekul 100 kDa dari model glukosa-glisin memberikan intensitas pencoklatan yang lebih kecil dibandingkan pada fraksi dengan berat molekul 100 kDa. Tabel 4.5.Intensitas browning pada sistem model larutan glukosa-glisin jumlah Fraksi berat molekul Da mg 1 100000 0.5 0.1 2 100000-50000 0.5 0.1 3 50000-30000 0.5 0.1 4 30000-10000 0.6 0.1 5 10000-3000 5.4 0.8 6 3000-1000 154.9 19.8 7 1000 632 78.4 jumlah 792.9 96.7 Hofmann 1998b Warna coklat pada produk M diduga karena proses pencoklatan enzimatis dan non enzimatis pada saat proses fermentasi moromi. Kedelai sebagai bahan baku moromi mengandung banyak senyawa fenolik, terutama dari jenis ortodihidroksi atau trihidroksi. Kedua senyawa ini merupakan substrat yang baik untuk proses pencoklatan enzimatis, sehingga jika ada oksigen dan enzim fenol oksidase maka proses pencoklatan akan terjadi. Sittiwat et al 2001 yang menjelaskan bahwa pencoklatan pada moromi yang tidak mengalami pemanasan tidak bergantung pada reaksi Maillard, pencoklatan akan terjadi meningkat jika jumlah protein dan peptida cukup. Pencoklatan yang dominan pada moromi tersebut adalah pencoklatan secara enzimatis. F1 pada produk M dan MP F4 pada produk M dan MP F1 pada produk kecap manis F4 pada produk kecap manis Gambar 4.14 Penampakan fraksi-fraksi produk M, MP, KGM dan KGP Pembentukan warna kecap selama proses moromi, pasteurisasi dan penyimpanan seiring dengan pembentukan flavor kecap sehingga banyak senyawa-senyawa yang merupakan produk dari reaksi pencoklatan sangat berkontribusi pada flavor kecap. Pada tahun 1996 Blank dan Fay menjelaskan bahwa sebenarnya senyawa 4-hidroksi-25-etil-52-metil-32H-furanon HEMF merupakan senyawa yang berasal dari reaksi Maillard dengan prekursor gula- gula pentosa. Gula – gula pentosa dihasilkan dari degradasi enzimatik kedelai dan gandum yang mulai terbentuk pada pembuatan koji. Senyawa lain seperti hidroksi metil furfural HMFmerupakan produk degradasi ARP selama pasteurisasi kecap melalui jalur 3-deoksiglukoson seperti: 3-deoksi-D-glukoson dan 3-deoksigalaktoson Yokotsuka 1986. Aldosa heksosa 3-deoksiglukoson senyawa HMF CHO C=O CH 2 -2H 2 O H-C-OH HOH2C O CHO H-C-OH CH 2 OH Pigmen larut air Pigmen larut air Serapan uv-vis pada produk M, hanya pada F4 terdapat peak yang intens, yaitu pada panjang gelombang 360 nm. Pada F3 peak broad lebar pada 307 nm dan 345 nm. Pada F1 ada peak kecil pada panjang gelombang 306 nm dan 348 nm, pada F2 dengan panjang gelombang 306 nm Gambar 4.15. Pada F1 produk MP lebih intens spektrumnya dibandingkan F1 produk M, yaitu pada panjang gelombang 350 nm, sedangkan F2 produk MP ada peak kecil pada panjang gelombang 306 nm. Pada F3 dan F4 produk MP peak cukup intens pada panjang gelombang 365 nm dan 350 nm Gambar 4.16. 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 200 250 300 350 400 450 500 panjang gelombang nm a b s o rb a n s i M F1 M F2 M F3 M F4 Keterangan: MF1: moromi dengan fraksi berat molekul 100 kDa; MF2: moromi dengan fraksi berat molekul 30-100 kDa; MF3: moromi dengan fraksi berat molekul 10-30 kDa; MF4: moromi dengan fraksi berat molekul 10 kDa Gambar 4.15. Spektrum UV-Vis fraksi-fraksi pada produk moromi M 0,5 1 1,5 2 2,5 200 250 300 350 400 450 500 panjang gelombang nm a b s o rb a n s i MP F1 MP F2 MP F3 MP F4 Keterangan: MPF1: moromi dipanaskan dengan fraksi berat molekul 100 kDa; MPF2: moromi dipanaskan dengan fraksi berat molekul 30-100 kDa; MPF3: moromi dipanaskan dengan fraksi berat molekul 10-30 kDa; MPF4: moromi dipanaskan dengan fraksi berat molekul 10 kDa Gambar 4.16. Spektrum UV-Vis fraksi-fraksi pada produk moromi dipanaskan MP Pada F4 produk M dan produk MP serapannya di sekitar panjang gelombang 350 nm - 360 nm yang sama-sama intens, diduga pada produk M terutama pada F4 juga terdapat produk reaksi Maillard. Produk reaksi Maillard pada produk M diduga ada karena pada saat pembuatan moromi sebelum proses fermentasi kapang dan garam, pada kedelai dilakukan pemanasan pada suhu 121 o C Lampiran 13. 0,5 1 1,5 2 2,5 200 250 300 350 400 450 500 panjang gelombang nm a b s o rb a n s i F1 F2 F3 F4 Keterangan: F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F2: fraksi dengan berat molekul 30-100 kDa; F3: fraksi dengan berat molekul 10-30 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa Gambar 4.17 Spektrum UV-Vis fraksi-fraksi pada produk kecap manis dengan gula merah KGM Ada peak kecil pada F1 produk KGM di 306 nm dan pada F2 ada peak di 306 nm dan 343 nm. Pada F3 produk KGM peak agak lebar di 380 nm, sedangkan F4 produk KGM peak cukup intens pada panjang gelombag 368 nm Gambar 4.17. Peak kecil juga terdapat pada F2 produk KGP dengan panjang gelombang di 306 nm dan 342 nm. Pada F1 produk KGP ada peak pada panjang gelombang 397 nm dan 348 nm. Pada F3 produk KGP pada panjang gelombang 397 nm dan peak cukup intens di F4 produk KGP pada panjang gelombang 403 nm Gambar 4.18. 0,5 1 1,5 2 2,5 200 250 300 350 400 450 500 panjang gelombang nm a b s o rb a n s i KGP F1 KGP F2 KGP F3 KGP F4 Keterangan: F1: fraksi dengan berat molekul 100 kDa; F2: fraksi dengan berat molekul 30-100 kDa; F3: fraksi dengan berat molekul 10-30 kDa; F4: fraksi dengan berat molekul 10 kDa Gambar 4.18 Spektrum UV-Vis fraksi-fraksi pada kecap manis dengan gula pasir KGP Perbedaan spektrum fraksi KGM dan KGP terletak pada F1 produk KGP yang lebih intens peaknya dan lebih besar serapannya dibandingkan F1 produk KGM, dan F4 produk KGP yang lebih intens serapannya dibandingkan F4 produk KGM, meskipun keduanya terletak pada panjang gelombang yang hampir sama. Hampir semua spektrum F1 dan F2 pada semua produk peaknya kecil, hal ini diduga karena pada F1 dan F2 total padatan sangat kecil, sedangkan pada F3 dan F4 total padatan lebih banyak. Jumlah padatan dan warna akan menentukan intensitas absorbansi pigmen dari pengukuran dengan menggunakan spektroskopi. Hampir semua serapan uv-vis pada fraksi-fraksi tiap produk mengindikasikan adanya senyawa produk reaksi Maillard. Pengukuran serapan uv-vis ini dengan melakukan pengenceran 5-10 kali sehingga fraksi yang terukur dengan benar. Tingginya absorbansi pada kisaran panjang gelombang 200-250 nm diduga karena banyaknya asam amino atau peptida yang terdapat pada tiap fraksi dari tiap produk M, MP, KGM dan KGP. C.5. Karakteristik Spectra-IR Pada fraksi-fraksi produk M, MP, KGM dan KGP mempunyai serapan yang cukup tajam di daerah sekitar 2060 cm -1 yang mengindikasikan gugus –OH...O dari -diketon atau kombinasi C=R=R Gambar 4.23 - 4.26. Selain itu band di sekitar daerah 600-900, 1020-1080, 1240-1265, 1350-1415, 1610-1650, 2300- 2360 dan 2900-3500 cm-1 menunjukkan gugus fungsional CH, COC, C=C, C=N, NH, N+H, COO dan gugus fungsional yang lain. Pada prinsipnya, spectra IR pada fraksi-fraksi semua produk M, MP, KGM dan KGP menunjukkan senyawa produk reaksi Maillard terutama struktur melanoidin, dimana merupakan senyawa polimer spreading bands. Posisi dan tipe karakteristik absorbsinya tidak banyak dipengaruhi oleh kondisi reaksi yang berbeda. Absorbsi IR yang ada dapat disesuaikan dengan yang didapat oleh Cammerer dan Kroh 1995 yang mendapatkan gugus –N=C- atau N + =C dan hipotesis struktur melanoidin pada Gambar 4.19 dibawah ini. Hipotesisnya menjelaskan bahwa elemen utama dalam struktur melanoidin merupakan penggabungan nitrogen dalam polimer melanoidin. Intensitas yang lebih kecil didapatkan pada amida sekunder dan juga amina sekunder dan tersier. CH 2 OH CH 2 OH CHOH CHOH CHOR H OH H CHR` CHOR H H CH 2 C = C – C 1 = N + - C 1 = C – C = C – C 1 = N + - C 1 – C = N - - CHOH H CH 2 OH H CR` H CHOH CHOR COOH CH 2 OH CHOH CH 2 OH contoh:amida, ester Gambar 4.19 Struktur melanoidin Cammerer dan Kroh, 1995 Struktur kimia melanoidin belum sepenuhnya dijelaskan dengan lengkap dalam publikasi-publikasi, untuk itu masih sulit menentukan dengan tepat, secara umum struktur melanoidin terdiri dari pengulangan gugus aromatik. Homma et al 1997 menjelaskan struktur melanoidin mirip dengan produk reaksi Amadori, dan juga merupakan unit pengulangan dari konyugasi ikatan rangkap karbon dan nitrogen tersier. Struktur ini sebagaimana halnya pada redukton, seperti enol dan enaminol. Kromatogram lengkap ada pada Lampiran 17, ringkasan dapat dilihat Tabel 4.6.

D. Senyawa yang Berperan sebagai Antioksidan