METODOLOGI PENELITIAN Aktivitas antioksidan fraksi-fraksi moromi, kecap manis dan model produk Reaksi Maillard berdasarkan berat molekul

II. METODOLOGI PENELITIAN

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia dan Biokimia, Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi dan di Laboratorium Kimia Pangan dan Gizi, Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan di Laboratorium Fisika Universitas Indonesia, Jakarta. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Agustus 2002 sampai dengan Juni 2005 dan November 2007 sampai Juni 2008 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah moromi yang diperoleh dari PT. Indofood Sukses Makmur dengan umur fermentasi 3 bulan, gula merah gula kelapa dan gula pasir.sukrosa. Bahan kimia yang digunakan untuk penetapan kadar α -amino nitrogen adalah trinitrobenzene sulfonic acid TNBS, Sigma - Aldrich, HCl 1N dan 0,02 M, leusin, dan untuk penetapan kadar protein dengan metode Kjeldahl digunakan K 2 SO 4, H 2 SO 4 , HGO, H 2 BO 3, Na 2 S 2 O 3 , NaOH, indikator metil merah dan biru, sedangkan untuk penetapan kadar protein terlarut dengan metode Lowry digunakan pereaksi Folin-Ciocalteau, Na-K tartarat, tembaga sulfat, Natrium karbonat, larutan bovine serum albumin BSA, E. Merck. Untuk penetapan kadar fenol digunakan etanol 95, Na 2 CO 3 5 dan asam tanat. Untuk pengukuran kadar gula digunakan larutan Fehling, dekstrosa standar, metilen biru, CaCO 3 , Pb-acetat, Na-oksalat dan asam sulfat. untuk uji sifat antioksidan digunakan minyak kedelai, air bebas ion, tween-80, asam thiobarbiturat, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, asam linoleat, buffer fosfat, NH 4 SCN, FeCl 2 dan HCl. Untuk uji antioksidan dalam sistem biologi digunakan phosphat bufer saline, biru triphan, H 2 O 2 dan darah dari donor yang sehat berjenis kelamin laki-laki. Peralatan utama yang digunakan meliputi seperangkat alat destilasi, Vortex, sentrifuse IEC Centra-815A, spektrofotometer shimadzu UV-160, stirred cell ultrafiltration kapasitas 50 ml Amicon Inc.Beverly,MS membrane ultrafiltrasi cut off 10; 30; 100 kDa, FTIR BIORAD Excalibur series, HPLC Shimadzu Co.Japan dan alat Rancimat 743 Metrohm, hemasitometer, inkubator bersuhu 37 o C dengan CO 2 5, spetrofotometer microplate reader dan mikroskop. Metode Penelitian Secara umum penelitian dilakukan mengikuti alur seperti pada Gambar 3.1. Tahapan penelitian ini meliputi : 1. Pengukuran kadar gula sukrosa, fruktosa, glukosa pada gula merah dan gula pasir 2. Pembuatan produk: moromi yang dipanaskan MP, kecap manis dengan gula merah KGM dan kecap manis dengan gula pasir KGP. Kemudian dilakukan beberapa analisis yang meliputi: kandungan air, protein, lemak, total padatan terlarut, gula pereduksi, dan komposisi asam amino 3. Fraksinasi terhadap ke empat jenis produk menggunakan membran ultrafiltrasi cut off 10; 30; dan 100 kDa. Pada masing-masing produk didapatkan 4 fraksi meliputi: Fraksi 1: BM 100 kDa Fraksi 2: BM 30 kDa – 100 kDa Fraksi 3: BM 10 kDa – 30 kDa Fraksi 4: BM 10 kDa Pada masing-masing fraksi tiap produk dilakukan analisis terhadap: a. kandungan protein, α -amino nitrogen, total fenol, total padatan dan pH. b. Serapan UV-Vis dan infra merah IR serta karakteristik pemisahan fraksi- fraksi produk dengan TLC dan HPLC. c. Uji aktivitas antioksidan pada fraksi tiap produk menggunakan metode rancimat, DPPH, penentuan bilangan TBA dan linoleat-tiosianat 4. Pembuatan sistem model dari produk reaksi Maillard MRP antara asam amino dengan gula pereduksi. Kemudian dilakukan fraksinasi dan uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode rancimat, DPPH, dan linoleat-tiosianat. 5. Untuk melihat aktivitas antioksidan dalam sistem biologi dilakukan pengujian terhadap penghambatan hemolisis eritrosit secara in vitro Pembuatan Produk MP, KGM dan KGP Sampel dalam penelitian ini meliput empat produki: Moromi M, moromi yang dipanaskan MP, kecap manis dengan gula merah KGM dan kecap manis dengan gula pasir KGP. Pembuatan produk moromi yang dipanaskan MP dilakukan dengan memanaskan moromi sebanyak 400 g selama 20 menit Umur fermentasi 3 bulan Gambar 3.1 Skema karakterisasi dan uji aktivitas antioksidan moromi dan kecap manis Moromi M Moromi dipanaskan MP 20 menit Kecap gula merah KGM Gula merah Gula pasir Pemanasan 45 menit,100 o C Pemanasan 20 menit,100 o C 75-78 o Brix Kecap gula pasir KGP Fraksinasi dengan stirred cell ultrafiltration Fraksi : - BM 100 kDa F1 - 30 kDa BM 100 kDa F2 - 10 kDa BM 30 kDa F3 - BM 10 kDa F4 Karakterisasi tiap fraksi : - Analisis total padatan, protein, total fenol, α -amino, serapan UV-Vis IR - Pengujian aktivitas antioksidan dengan:Rancimat,TBA,DPPH, tiosianat - Pengujian penghambatan terhadap Hemolisis sel eritrosit manusia Disentrifus 3000 rpm, 4 o C, 20 menit Penambahan dengan air 1 : 2 bv Analisis: Kadar air, lemak, protein, asam amino, pH Total padatan terlarut, gula reduksi pada suhu 100 o C, sedangkan pembuatan kecap manis KGM dan KGP dengan memanaskan gula 500 g dan air 150 g selama 45 menit pada suhu 100 o C. kemudian ditambahkan moromi sebanyak 400 g dan pemanasan dilanjutkan selama 20 menit Gambar 3.2 Gula 500 g + air 150 g Penambahan dengan moromi 400 g Kecap manis KGMKGP Gambar 3.2. Skema pembuatan kecap manis Wiratma, 1995 Setelah didapatkan ke empat produk M, MP, KGM dan KGP masing- masing dilakukan penambahan dengan aquades 1:2 dan diaduk sampai homogen, kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit. Setelah itu dilakukan penyaringan dengan kertas Whatman 1 dan membran 0.45 µm. Kemudian produk-produk tersebut disimpan dalam freezer untuk siap digunakan analisis lebih lanjut dan proses fraksinasi. Proses Fraksinasi dengan Ultrafiltrasi Proses fraksinasi dilakukan dengan ultrafiltration stirred cell volume 50 ml Amicon dan reservoar volume 100 ml pada suhu refrigerator 5 - 10 o C dan tekanan gas nitrogen 2.5 – 3 bar. Kecepatan penyaringan berkisar 0.5 – 10 mljam. Waktu filtrasi disesuaikan dengan volume yang diinginkan, waktu penyaringan semakin lama dengan semakin kecilnya molecular weight cutt-off MWCO dari membran. Pemanasan 45 menit, 100 o C Pemanasan 20 menit, 100 o C Proses fraksinasi dimulai dengan memisahkan cairan dari filtrat moromi M, MP, KGM dan KGP masing-masing sebanyak 50 ml dari komponen yang tidak larut dengan menggunakan membran 0.45 µm Milipore. Kemudian fraksinasi dilanjutkan dengan menggunakan membran 100 kDa, 30 kDa dan 10 kDa. Proses fraksinasi ini menghasikan 4 fraksi, yaitu filtrat yang lolos membran 0.45 µm dan tertahan oleh membran 100 kDa disebut fraksi 1, filtrat yang lolos membran 100 kDa dan tertahan oleh membran 30 kDa disebut dengan fraksi 2, filtrat yang lolos membran 30 kDa dan tertahan oleh membran 10 kDa disebut dengan fraksi 3 dan yang terakhir filtrat yang lolos membran 10 kDa disebut dengan fraksi 4. Setiap filtrat akhir yang tertahan oleh membran 100 kDa atau 30 kDa dilakukan pencucian satu kali dengan aquades sebanyak volume awal 50 ml. Proses fraksinasi ini juga dilakukan pada sistem model produk reaksi Maillard yang dibuat. Gambar 3.3. Skema Proses Fraksinasi dengan Ultrafiltrasi Pembuatan Sistem Model Sistem model dibuat dengan menggunakan asam amino dan satu jenis gula pereduksi. Model ini dibuat untuk mengetahui kemampuan aktivitas antioksidan dari model dan membuktikan bahwa senyawa produk reaksi Maillard pada produk kecap manis dapat berperan sebagai antioksidan. Banyaknya gula dan asam amino yang dipergunakan sesuai kadar gula yang terdapat pada gula membran 0.45 µm membran 100 kDa sisa volume 10 ml membran 30 kDa sisa volume 10 ml Fraksi 4 Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Volume awal 50 ml Pencucian dengan aquades sebanyak 40 ml membran 10 kDa sisa volume 10 ml merahgula pasir dan asam amino yang terdapat pada moromi yang dipergunakan dalam pembuatan kecap manis. Glukosa yang dipergunakan sebanyak 0.778 g 4.32 mmol dan asam amino glisin sebanyak 1.34 mg 0.01 mmol, sistein 2.9 mg 0.02 mmol, phenilalanin 1.4 mg 0.009 mmol, isoleusin 2.29 mg 0.017 mmol dan tirosin 1.9 mg 0.01 mmol. Setiap model asam amino dan glukosa dilarutkan dalam buffer fosfat 0.1 M pH 5.5 sebanyak 100 ml. Kemudian dilakukan pemanasan dengan hot plate dengan sistem refluks. Sistem model yang dibuat meliputi: Tabel 3.1 Pembuatan model 1 Model konsentrasi lama pemanasan Glukosa-glisin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-glisin sesuai pada moromi 2 jam 10 menit Glukosa-glisin sesuai pada moromi 6 jam Glukosa-glisin 0.1M 2 jam Glukosa-glisin 0.1M 6 jam Glukosa+5 jenis as.amino sesuai pada moromi 65 menit Kemudian dibuat lagi sistem model dengan menggunakan variasi macam asam amino untuk mengetahui asam amino yang lebih berperan dalam aktivitas antioksidan. Tabel 3.2 Pembuatan model 2 Model Konsentrasi Lama pemanasan Glukosa-glisin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-isoleusin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-phenilalanin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-tirosin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-isoleusin-phenilalanin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-glisin-phenilalanin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-phenilalanin-isoleusin- tirosin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-glisin-sistein sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-sistein-phenilalanin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-glisin-sistein-phenilalanin sesuai pada moromi 65 menit Selanjutnya dibuat sistem model yang terakhir menggunakan lama pemanasan 65 menit dan konsentrasi glukosa dan asam amino yang telah disebutkan di atas Tabel 3.3 Pembuatan model 3 Model Konsentrasi lama pemanasan Glukosa – glisin - sistein sesuai pada moromi 65 menit Glukosa – glisin – sistein – phenilalanin sesuai pada moromi 65 menit Glukosa-glisin-sistein-phenilalanin- isoleusin-tirosin sesuai pada moromi 65 menit Pada model 3 setelah pemanasan langsung didinginkan dengan segera disimpan dalam lemari pendingin. Setelah dingin dilakukan fraksinasi dengan ultrafiltrasi dengan menggunakan membran 100 kDa, 30 kDa dan 10 kDa. Hasil ultrafiltrasi ini didapatkan 4 fraksi, yaitu: Fraksi 1 F1 : BM 100 kDa Fraksi 2 F2 : BM 30 – 100 kDa Fraksi 3 F3 : BM 10 – 30 kDa Fraksi 4 F4 : BM 10 kDa Kemudian setiap fraksi dilakukan pengamatan terhadap serapan uv-vis dan kemampuannya sebagai antioksidan dengan metode rancimat, DPPH dan linoleat-tiosianat. Alur penelitian model 3: glu-gli-sis, glu-gli-sis-phe dan glu-gli- sis-phe-iso-tir G-5.AA dapat dilihat pada Gambar 3.4. Karakterisasi Kimia pada Produk M, MP, KGM, KGP Karakterisasi kimia dilakukan dengan menganalisis kandungan air, protein, pH, total padatan terlarut, gula pereduksi, lemak dan asam amino pada produk M, MP, KGM dan KGP, dan pengukuran terhadap kadar gula sukrosa, fruktosa dan glukosa pada gula merah dan gula pasir serta karakterisasi terhadap kandungan protein, α -amino nitrogen, total fenol, total padatan, pH, serapan UV-Vis dan IR pada tiap fraksi dari tiap produk mengikuti prosedur analisis sebagai berikut. Gambar 3.4. Skema proses pembuatan model 3 dan uji aktivitas antioksidan Glukosa-glisin-sistein Glukosa-Glisin-Sistein- Phenilalanin-Isoleusin-Tirosin Glukosa-Glisin-Sistein-Phenilalanin Fraksinasi dengan stirred cell ultrafiltration Fraksi : - BM 100 kDa F1 - 30 kDa BM 100 kDa F2 - 10 kDa BM 30 kDa F3 - BM 10 kDa F4 - Pengamatan serapan UV-Vis - Pengujian aktivitas antioksidan dengan:Rancimat, DPPH, tiosianat - Pengujian penghambatan terhadap Hemolisis sel eritrosit manusia Dilarutkan dalam buffer fosfat 0.1 M pH 5.5 Pemanasan selama 65 menit pada suhu 100 o C Pendinginan model: Glu-gli-sis model: Glu – 5.AA model: Glu-Gli-Sis-Phe Penentuan Kadar Sukrosa, Fruktosa dan Glukosa Penentuan kadar sukrosa, fruktosa dan glukosa dilakukan pada gula merah dan gula pasir. Pada gula merah dan gula pasir terlebih dahulu dilakukan preparasi sebagai berikut: gula merah dan gula pasir masing-amsing sebanyak 10 g ditambahkan pada aquades 50 ml dan CaCO 3 3 g, kemudian dipanaskan 80 o C selama 30 menit. Pb-acetat jenuh ditambahkan sampai endapan yang terbentuk hilang. Aliquot ditera 100 ml dan disaring dengan Whatman No.42. Kemudian ditambahkan Na-oksalat 3 g dan disaring lagi dengan Whatman No 42. Sampel siap diinjeksikan pada HPLC. Kondisi HPLC sebagai berikut: kolom aminex, flow rate 0.4 mlmin, eluent H 2 SO 4 0.05 M, tekanan 125 Kg Fcm2 dan panjang gelombang 325 nm Analisis Gula Pereduksi dengan metode Lane-eynon Apriyantono et al . 1989 Pada masing-masing produk M, MP, KGM dan KGP diambil sebanyak 10 ml dan ditambahkan larutan Fehling 10 ml sudah distandarisasi. Kemudian ditambahkan larutan dekstrosa standar 5 ml. Campuran ini dititrasi dengan dekstrosa standar dan ditambahkan metilen biru. Penentuan persentase gula reduksi didapatkan dari dekstrosa sebagai titer penetapan larutan standar, blanko dan sampel Komposisi Asam Amino Analisis komposisi asam amino menggunakan High performance Liquid Chromatography HPLC. Penyiapan sampel dilakukan dengan menambahkan HCl 6 N 5 ml pada produk M, MP, KGM dan KGP sebanyak 0.25 g kemudian dipanaskan pada suhu 100 o C selama 20 jam selanjutnya dilakukan pengenceran 10 kali dengan aquades dan penyaringan. Sampel yang sudah mengalami pemanasan dan penyaringan ini diambil 30 µ l untuk didinginkan selama 20 menit dan kemudian ditambahkan Na-acetat sebanyak 20 ml. Sampel siap diinjeksikan pada HPLC. Kondisi HPLC sebagai berikut: kolom yang digunakan pico Tag 3.9 X 150 nm dengan flow rate 2 mlmin dan tekanan 3000 psi dengan fase gerak asetonitril 60, buffer natrium asetat pH 5.75, detektor UV, panjang gelombang 254 nm dan volume injeksi 2 µ l. Penghitungan persen asam amino dalam sampel : asam amino = luas area sampel x 5 µ g x BM x 10 x 100 luas area standar as.amino 250.000 Kadar protein dengan metode Lowry Lowry et al 1951 Analisa ini mekanismenya merupakan reaksi antara Cu 2+ dengan ikatan peptida dari sampel serta reduksi dari asam fosfomolobdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan dan triptofan yang menghasilkan warna biru. Analisis dilakukan dengan mengambil masing-masing fraksi tiap produk M, MP, KGM dan KGP sebanyak 2 ml ditambah aquades 2 ml serta 5,5 ml pereaksi berupa campuran larutan natrium karbonat 2 dalam larutan NaOH 0,1 N dan tembaga sulfat 0,5 dalam larutan Na-K tartarat 1 50:1, kemudian dilakukan pengadukan dan dibiarkan selama 10-15 menit pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan penambahan 0,5 ml pereaksi Folin-Ciocalteau, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 650 nm. Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan bovine serum albumin 0,25 mgml. Kadar α αα α -Amino Nitrogen Adler-Niesen 1979 Analisa ini bertujuan untuk menentukan kadar α -amino dengan menggunakan pereaksi TNBS trinitrobenzene sulfonic acid . Pada pH 8, asam trinitrobenzensulfonat bereaksi dengan gugus alfa amino bebas`menghasilkan senyawa berwarna. Analisis dilakukan dengan mengambil fraksi-fraksi tiap produk M, MP, KGM dan KGP sebanyak 0,1 ml dan volume ditepatkan menjadi 1 ml menggunakan buffer fosfat pH 8,2. Kemudian ditambahkan 1 ml larutan TNBS 0,1, dilakukan pengadukan dan direndam dalam penangas air pada suhu 40 o C selama 2 jam dalam tabung reaksi yang tertutup semua. Reaksi dihentikan dengan cara menambahkan 1ml HCl 1 N, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 340 nm. Kurva standar dibuat dengan larutan leusin 10 mgml. Kadar Total Fenol Shetty 1999 Analisis dilakukan dengan mengambil fraksi-fraksi tiap produk M, MP, KGM dan KGP sebanyak 1ml dan ditambahkan 1 ml etanol 95 serta aquades 5 ml. Kemudian ditambahkan 0.5 ml Folin Ciocalteau 50 dan ditunggu selama 5 menit, baru kemudian ditambahkan Na 2 CO 3 5 sebanyak 1 ml dicampur dengan menggunakan vortex. Setelah itu diinkubasikan dalam ruangan gelap selama 30 menit. Dilakukan vortex lagi dan kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 725 nm. Kurva standar dibuat dengan larutan asam tanat Absorbsi UV-Vis Pengukuran absorbsi UV-Vis menggunakan spektrofotometer Shimadzu UV-160 dilakukan pada tiap fraksi dari tiap produk M, MP, KGM dan KGP serta model dengan kisaran panjang gelombang 200 – 500 nm. Hal ini bertujuan untuk memberikan dugaan senyawa-senyawa yang dominan dalam tiap fraksi. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan mengambil 1 ml tiap fraksi dengan pengenceran sebanyak lima kali untuk mendapatkan spektrum yang jelas. Spectra IR Identifikasi gugus fungsional tiap fraksi dengan Fourier Transformation Infra Red FTIR. Pada masing-masing fraksi tiap produk dicampur dengan KBr dengan perbandingan 1100 untuk dibentuk menjadi pelet, kemudian pelet ini dianalisis dengan FTIR BIORAD Excalibur series dengan kisaran bilangan gelombang 400-4000 cm -1 Pemisahan senyawa yang terdapat dalam tiap fraksi Arnoldi et al 1997 dan Kurata et al 1973 Pada fraksi F1 dan F4 tiap produk M, MP, KGM dan KGP diteteskan pada lempeng TLC thin layer chromatografi secukupnya menggunakan pipa kapiler dan dibiarkan kering. Kemudian di elusi menggunakan berbagai komposisi pelarut, hal ini bertujuan untuk mendapatkan spot pemisahan yang paling baik. Komposisi pelarut yang digunakan sebagai berikut : khloroform:etil asetat:etanol 15:2:2; 5:2:2; 1:2:2 dan butanol:etanol:H 2 O:asam asetat 50:20:30:1; 30:20:30:20; 20:20:30:1; 20:30:30:30; 20:20:10:20; 10:20:20:10; 10:30:30:30; serta pelarut etil asetat:pyridine:H 2 O 10:4:3; 8:4:3 dan ditunggu sampai fase bergerak mencapai sekitar 2 cm dari pinggir atas TLC. Setelah kering lempeng TLC diamati spot yang terbentuk. Spot yang didapat dideteksi di bawah sinar ultraviolet dengan panjang gelombang 254 nm. Hasil pemisahan yang didapat dibandingkan dengan literatur. Selanjutnya spot yang dihasilkan oleh fraksi-fraksi yang dilewatkan pada TLC dilakukan pengerokan dan dilarutkan kembali ke dalam pelarut kemudian diinjeksikan pada HPLC. Kondisi HPLC sebagai berikut: kolom yang digunakan C-18 dengan flow rate 1 mlmin dan tekanan 3000 psi dengan eluent metanol, detektor UV, panjang gelombang 420-460 nm dan volume injeksi 2 µ l. Analisis antioksidan dengan rancimat Minyak kedelai sebanyak 10 ml dan ditambahkan 1 ml fraksi-fraksi dari tiap produk M, MP, KGM, KGP dan model sebanyak 1 ml diaduk dengan ditambahkan tween 80 agar tercampur secara homogen. Minyak kedelai yang sudah ada sampelnya ini diambil sebanyak 3 g dan dimasukkan dalam tabung rancimat dan dihubungkan pada aliran udara dengan menggunakan suhu sekitar 110 o C. Produk oksidasinya ditransfer untuk diukur dan demikian juga absorbsinya dalam air destilat. Nilai konduktivitas sebagai produk sekunder dari oksidasi lipida dari pengukuran ini akan muncul kurva oksidasi yang diperoleh dari perubahan waktu induksi. Hal ini merupakan nilai karakteristik dari stabilitas oksidasi. Efisiensi antioksidan indeks protektif dinyatakan sebagai perbandingan waktu induksi lipida mengandung antioksidan terhadap waktu induksi lipida tanpa antioksidan. Hasil ini juga dibandingkan dengan antioksidan BHT. Indek protektif = Waktu induksi fraksi Waktu induksi kontrol Analisis antioksidan dengan penetapan bilangan TBA Bedinghaus 1995 Sebanyak 5 ml fraksi tiap produk M, MP, KGM, KGP dan 5 ml TBA t hiobarbituric acid 0.02 M ditempatkan dalam tabung reaksi tertutup. Kemudian dilakukan pengocokan sebanyak tiga kali dan setelah itu didiamkan dalam ruangan gelap pada suhu ruang selama 15 jam. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 530 nm. Nilai absorbansi yang didapat dikalikan dengan nilai K dari kurva standar. Nilai K = SA MW 107SW100P Keterangan : SA = slope dari kurva standar 6.195 x 10-8 MW = berat molekul dari malonaldehid 72,03 SW = berat sampel yang dianalisis P = recovery yang ditambah standar 1,1,3,3-tetramethoxypropane TMP. Analisis antioksidan dengan radikal DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Cheung et al 2003 Sebanyak 1 ml fraksi tiap produk M, MP, KGM, KGP dan model ditambahkan 0.5 ml DPPH dalam metanol 0.1 mM di vortex, kemudian segera ditentukan absorbannya pada panjang gelombang 520 nm Aktivitas antioksidan = 1 – Absorbansi fraksi x 100 Absorbansi blanko Uji Fe III thiosianat Tressl Wondrak, 1998 Sebanyak 2 µ l fraksi tiap produk M, MP, KGM, KGP dan model dalam 2 ml etanol 99.5 ditambahkan pada 2.052 ml asam linoleat 2.51 dalam 99.5 etanol, 4 ml buffer fosfat 0.05 M, pH 7 dan 1.948 ml air destilat. Kemudian ditempatkan pada waterbath 40 o C selama satu minggu. Tiap 24 jam aliquot diambil 0.1 ml dan ditambahkan pada 9.7 ml etanol 75 vv dan 0.1 ml NH 4 SCN 30 wv, dikocok dan kemudian ditambahkan 0.1 ml FeCl 2 0.02 M dalam HCl 3.55. Didiamkan selama 3 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm Aktivitas antioksidan = 1 – Absorbansi fraksi x 100 Absorbansi blanko Pengujian Aktivitas Antioksidan dalam Sistem Biologi Menggunakan Sel Eritrosit sebagai Model

a.Isolasi sel eritrosit manusia Nike et al

1988 dan Zhu 2002 Pengujian aktivitas antioksidan ini dilakukan secara in vitro. Darah diambil dari donor sehat berjenis kelamin laki-laki dan pengambilan dilakukan secara aseptis kurang lebih sebanyak 30 ml dimasukkan dalam tabung vacuntee steril yang sudah mengandung antikoagulan CPDA 0.1 citrate phosphate dextrose adenin . Darah tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse steril dan pengerjaannya dilakukan dalam laminar hood selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Sel eritrosit yang mengendap di bawah dicuci dengan menggunakan PBS phosphat buffer saline lima kali volume sel eritrosit yang diambil. Kemudian sebanyak 1 ml sel eritrosit dicuci dengan 5 ml larutan PBS kemudian disentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Sel eritrosit akan mengendap di dasar tabung dan larutan PBS akan berwarna kuning jernih. Suspensi eritrosit kemudian diencerkan agar jumlah sel dapat dihitung dan sel yang hidup harus lebih dari 95 Sel darah meraheritrosit b. Penghitungan jumlah sel eritrosit manusia Jumlah sel eritrosit yang ada dalam suspensi dihitung menggunakan hemasitometer . Sebanyak 100 µl suspensi eritrosit hasil pencucian dengan PBS dari prosedur isolasi di atas diambil lalu ditambah dengan PBS lagi sebanyak 1400 µl. Dari suspensi sel eritrosit ini diambil 100 µl lalu ditambah 1400 µl PBS. Kemudian diambil 25 µl suspensi sel eritrosit dicampur dengan biru triphan 0.2 diaduk dan ditempatkan pada hemasitometer. Larutan pewarna biru triphan dibuat dengan melarutkan 20 mg bubuk biru triphan dalam 10 ml air bebas ion. Kemudian campuran sel eritrosit dan biru triphan ini dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran total 400 kali. Sel yang hidup akan berwarna jernih pada dinding selnya, sedangkan sel yang mati terlihat biru seluruhnya. Jumlah sel yang hidupdihitung dan penghitungannya dilakukan dalam waktu kurang dari 3 menit, untuk mencegah adanya penyerapan warna oleh sel hidup karena adanya afinitas yang kuat dari biru triphan pada DNA. Rumus perhitungan sel eritrosit dengan menggunakan hemasitometer adalah sebagai berikut: N = A x FP x 10 4 selml N = jumlah sel per mililiter A = rata-rata jumlah sel terhitung FP = Faktor pengenceran penambahan 50 µl biru triphan dan 50 µl suspensi sel

c. Uji terhadap hemolisis eritrosit manusia

Pada pengujian penghambatan hemolisis sel eritrosit ini digunakan sampel dari: 1. Kecap manis KGP: F1 BM100 kDa dan F4 BM10kDa 2. Model G-5.AA: F1 BM100 kDa dan F4 BM10kDa Konsentrasi H 2 O 2 yang digunakan untuk oksidator adalah 3.3 mM Dewi 2008 dan metode analisis dengan menggunakan metode sentrifugasi tunggal Dewi 2008. Pengujian dengan menggunakan oksidator H 2 O 2 dan tanpa H 2 O 2 . Disiapkan 1 set tabung eppendorf dengan masing-masing fraksi yang akan diuji dan duplo. Volume akhir suspensi yang digunakan untuk tiap eppendorf adalah 800 µl. Suspensi sel eritrosit stok dengan konsentrasi 20x10 7 selml. Suspensi sel sebanyak 160 µl dimasukkan dalam tabung eppendorf kemudian ditambahkan fraksi-fraksi yang akan diuji sebanyak 160 µl. Selanjutnya ditambahkan larutan H 2 O 2 stok sebanyak 160 µl, inkubasi di inkubator bersuhu 37 o C dengan CO 2 5 hingga waktu pengamatan dari jam ke-0 sampai jam ke-5. Untuk lebih jelasnya rincian volume masing-masing perlakuan dapat dilihat Tabel 3.1-3.2 Tabel 3.4 Pengujian penghambatan hemolisis dengan oksidator H 2 O 2 Jenis fraksi Volume µl fraksi sel eritrosit H 2 O 2 PBS kontrol - 160 160 480 KGP100kDa 160 160 160 320 KGP10 kDa 160 160 160 320 G-5.AA100kDa 160 160 160 320 G-5.AA10kDa 160 160 160 320 Ket: KGP:kecap manis dengan gula pasir; G-5.AA: glukosa dengan glisin,sistein,phenilalanin,isoleusin,tirosin PBS: fosfat buffer saline Tabel 3.5 Pengujian penghambatan hemolisis tanpa oksidator H 2 O 2 Jenis fraksi Volume µl fraksi sel eritrosit PBS kontrol 160 640 KGP100kDa 160 160 480 KGP10 kDa 160 160 480 G-5.AA100kDa 160 160 480 G-5.AA10kDa 160 160 480 Ket: KGP:kecap manis dengan gula pasir; G-5.AA: glukosa dengan glisin,sistein,phenilalanin,isoleusin,tirosin PBS: fosfat buffer saline Pengamatan dimulai dengan mengambil 1 set eppendorf untuk disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan sel darah merah. Sebanyak 150 µl supernatan diambil dan dimasukkan ke 96- well plate dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spectrofotometer microplate reader pada panjang gelombang 450 nm. Pada pengamatan jam ke-5 dilakukan penghitungan sel yang hidup dengan metode pewarnaan biru trifan. Pencegahan hemolisis = abs.kontrol – abs. Sampel X 100 abs.kontrol Keterangan: Abs.kontrol : absorbansi suspensi eritrosit + oksidator H 2 O 2 Abs. Sampel : absorbansi suspensi eritrosit + fraksi sampel + oksidator – absorbansi fraksi sampel Untuk pengujian yang tanpa menggunakan oksidator H 2 O 2 maka perhitungan persen penghambatan hemolisis tanpa menggunakan absorbansi oksidator H 2 O 2 Analisis Statistik Rancangan percobaan yang dipergunakan untuk mengetahui karakteristik kimia dan aktivitas antioksidan antar fraksi-fraksi pada moromi dan kecap manis adalah rancangan acak lengkap bentuk faktorial. Model liniernya adalah: Y = µ + A i + B j + AB ij + ijn Dimana: Y : Respon percobaan terhadap pengaruh jenis perlakuan M, MP, KGM, KGP dan jenis fraksi pada ulangan ke-n µ : rata-rata umum A i : Pengaruh perlakuan A jenis kecap pada taraf ke-i B j : Pengaruh perlakuan B jenis fraksi pada taraf ke-j AB ij :Pengaruh interaksi pelakuan A dan perlakuan B ijn : Pengaruh kesalahan percobaan pada ulangan ke-n karena pengaruh A i , B j dan AB ij Multiple comparison dilakukan dengan menggunakan one way analysis of variance ANOVA dimana nilai p0.05 dianggap signifikan secara statistik dilanjutkan dengan uji Duncan.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN