II. METODOLOGI PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia dan Biokimia, Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi dan di Laboratorium Kimia Pangan dan Gizi,
Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan di Laboratorium Fisika Universitas Indonesia, Jakarta.
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Agustus 2002 sampai dengan Juni 2005 dan November 2007 sampai Juni 2008
Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah moromi yang diperoleh dari PT. Indofood Sukses Makmur dengan umur fermentasi 3 bulan,
gula merah gula kelapa dan gula pasir.sukrosa. Bahan kimia yang digunakan untuk penetapan kadar
α -amino nitrogen adalah trinitrobenzene sulfonic acid
TNBS, Sigma - Aldrich, HCl 1N dan 0,02 M, leusin, dan untuk penetapan kadar protein dengan metode Kjeldahl digunakan K
2
SO
4,
H
2
SO
4
, HGO, H
2
BO
3,
Na
2
S
2
O
3
, NaOH, indikator metil merah dan biru, sedangkan untuk penetapan kadar protein
terlarut dengan metode Lowry digunakan pereaksi Folin-Ciocalteau, Na-K tartarat, tembaga sulfat, Natrium karbonat, larutan bovine serum albumin BSA,
E. Merck. Untuk penetapan kadar fenol digunakan etanol 95, Na
2
CO
3
5 dan asam tanat. Untuk pengukuran kadar gula digunakan larutan Fehling, dekstrosa
standar, metilen biru, CaCO
3
, Pb-acetat, Na-oksalat dan asam sulfat. untuk uji sifat antioksidan digunakan minyak kedelai, air bebas ion, tween-80, asam
thiobarbiturat, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, asam linoleat, buffer fosfat, NH
4
SCN, FeCl
2
dan HCl. Untuk uji antioksidan dalam sistem biologi digunakan phosphat bufer saline, biru triphan, H
2
O
2
dan darah dari donor yang sehat berjenis kelamin laki-laki.
Peralatan utama yang digunakan meliputi seperangkat alat destilasi, Vortex, sentrifuse IEC Centra-815A, spektrofotometer shimadzu UV-160, stirred cell
ultrafiltration kapasitas 50 ml Amicon Inc.Beverly,MS membrane ultrafiltrasi cut off 10; 30; 100 kDa, FTIR BIORAD Excalibur series, HPLC Shimadzu
Co.Japan dan alat Rancimat 743 Metrohm, hemasitometer, inkubator bersuhu 37
o
C dengan CO
2
5, spetrofotometer microplate reader dan mikroskop.
Metode Penelitian
Secara umum penelitian dilakukan mengikuti alur seperti pada Gambar 3.1. Tahapan penelitian ini meliputi :
1. Pengukuran kadar gula sukrosa, fruktosa, glukosa pada gula merah dan gula pasir
2. Pembuatan produk: moromi yang dipanaskan MP, kecap manis dengan gula merah KGM dan kecap manis dengan gula pasir KGP. Kemudian
dilakukan beberapa analisis yang meliputi: kandungan air, protein, lemak, total padatan terlarut, gula pereduksi, dan komposisi asam amino
3. Fraksinasi terhadap ke empat jenis produk menggunakan membran ultrafiltrasi cut off 10; 30; dan 100 kDa. Pada masing-masing produk
didapatkan 4 fraksi meliputi: Fraksi 1: BM 100 kDa
Fraksi 2: BM 30 kDa – 100 kDa Fraksi 3: BM 10 kDa – 30 kDa
Fraksi 4: BM 10 kDa Pada masing-masing fraksi tiap produk dilakukan analisis terhadap:
a. kandungan protein, α
-amino nitrogen, total fenol, total padatan dan pH. b. Serapan UV-Vis dan infra merah IR serta karakteristik pemisahan fraksi-
fraksi produk dengan TLC dan HPLC. c. Uji aktivitas antioksidan pada fraksi tiap produk menggunakan metode
rancimat, DPPH, penentuan bilangan TBA dan linoleat-tiosianat 4. Pembuatan sistem model dari produk reaksi Maillard MRP antara asam
amino dengan gula pereduksi. Kemudian dilakukan fraksinasi dan uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode rancimat, DPPH, dan
linoleat-tiosianat. 5. Untuk melihat aktivitas antioksidan dalam sistem biologi dilakukan pengujian
terhadap penghambatan hemolisis eritrosit secara in vitro
Pembuatan Produk MP, KGM dan KGP
Sampel dalam penelitian ini meliput empat produki: Moromi M, moromi yang dipanaskan MP, kecap manis dengan gula merah KGM dan kecap
manis dengan gula pasir KGP. Pembuatan produk moromi yang dipanaskan MP dilakukan dengan memanaskan moromi sebanyak 400 g selama 20 menit
Umur fermentasi 3 bulan
Gambar 3.1 Skema karakterisasi dan uji aktivitas antioksidan moromi dan kecap manis
Moromi M
Moromi dipanaskan MP 20 menit
Kecap gula merah KGM
Gula merah Gula pasir
Pemanasan 45 menit,100
o
C Pemanasan 20 menit,100
o
C 75-78
o
Brix
Kecap gula pasir KGP
Fraksinasi dengan stirred cell ultrafiltration
Fraksi : - BM 100 kDa F1 - 30 kDa BM 100 kDa F2
- 10 kDa BM 30 kDa F3 - BM 10 kDa F4
Karakterisasi tiap fraksi : - Analisis total padatan, protein, total fenol,
α -amino, serapan UV-Vis IR
- Pengujian aktivitas antioksidan dengan:Rancimat,TBA,DPPH, tiosianat - Pengujian penghambatan terhadap Hemolisis sel eritrosit manusia
Disentrifus 3000 rpm, 4
o
C, 20 menit Penambahan dengan air 1 : 2 bv
Analisis: Kadar air, lemak, protein, asam amino, pH Total padatan terlarut, gula reduksi
pada suhu 100
o
C, sedangkan pembuatan kecap manis KGM dan KGP dengan memanaskan gula 500 g dan air 150 g selama 45 menit pada suhu 100
o
C. kemudian ditambahkan moromi sebanyak 400 g dan pemanasan dilanjutkan
selama 20 menit Gambar 3.2 Gula 500 g + air 150 g
Penambahan dengan moromi 400 g
Kecap manis KGMKGP
Gambar 3.2. Skema pembuatan kecap manis Wiratma, 1995 Setelah didapatkan ke empat produk M, MP, KGM dan KGP masing-
masing dilakukan penambahan dengan aquades 1:2 dan diaduk sampai homogen, kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm pada
suhu 4
o
C selama 20 menit. Setelah itu dilakukan penyaringan dengan kertas Whatman 1 dan membran 0.45 µm. Kemudian produk-produk tersebut disimpan
dalam freezer untuk siap digunakan analisis lebih lanjut dan proses fraksinasi.
Proses Fraksinasi dengan Ultrafiltrasi
Proses fraksinasi dilakukan dengan ultrafiltration stirred cell
volume 50 ml Amicon dan reservoar volume 100 ml pada suhu refrigerator 5 - 10
o
C dan tekanan gas nitrogen 2.5 – 3 bar. Kecepatan penyaringan berkisar 0.5 – 10
mljam. Waktu filtrasi disesuaikan dengan volume yang diinginkan, waktu penyaringan semakin lama dengan semakin kecilnya
molecular weight cutt-off MWCO dari membran.
Pemanasan 45 menit, 100
o
C
Pemanasan 20 menit, 100
o
C
Proses fraksinasi dimulai dengan memisahkan cairan dari filtrat moromi M, MP, KGM dan KGP masing-masing sebanyak 50 ml dari komponen yang
tidak larut dengan menggunakan membran 0.45 µm Milipore. Kemudian fraksinasi dilanjutkan dengan menggunakan membran 100 kDa, 30 kDa dan 10
kDa. Proses fraksinasi ini menghasikan 4 fraksi, yaitu filtrat yang lolos membran 0.45 µm dan tertahan oleh membran 100 kDa disebut fraksi 1, filtrat yang lolos
membran 100 kDa dan tertahan oleh membran 30 kDa disebut dengan fraksi 2, filtrat yang lolos membran 30 kDa dan tertahan oleh membran 10 kDa disebut
dengan fraksi 3 dan yang terakhir filtrat yang lolos membran 10 kDa disebut dengan fraksi 4. Setiap filtrat akhir yang tertahan oleh membran 100 kDa atau 30
kDa dilakukan pencucian satu kali dengan aquades sebanyak volume awal 50 ml. Proses fraksinasi ini juga dilakukan pada sistem model produk reaksi
Maillard yang dibuat.
Gambar 3.3. Skema Proses Fraksinasi dengan Ultrafiltrasi
Pembuatan Sistem Model
Sistem model dibuat dengan menggunakan asam amino dan satu jenis gula pereduksi. Model ini dibuat untuk mengetahui kemampuan aktivitas antioksidan
dari model dan membuktikan bahwa senyawa produk reaksi Maillard pada produk kecap manis dapat berperan sebagai antioksidan. Banyaknya gula dan
asam amino yang dipergunakan sesuai kadar gula yang terdapat pada gula
membran 0.45 µm membran 100 kDa
sisa volume 10 ml membran 30 kDa
sisa volume 10 ml
Fraksi 4 Fraksi 1
Fraksi 2
Fraksi 3
Volume awal 50 ml
Pencucian dengan aquades sebanyak 40 ml
membran 10 kDa sisa volume 10 ml
merahgula pasir dan asam amino yang terdapat pada moromi yang dipergunakan dalam pembuatan kecap manis. Glukosa yang dipergunakan
sebanyak 0.778 g 4.32 mmol dan asam amino glisin sebanyak 1.34 mg 0.01 mmol, sistein 2.9 mg 0.02 mmol, phenilalanin 1.4 mg 0.009 mmol, isoleusin
2.29 mg 0.017 mmol dan tirosin 1.9 mg 0.01 mmol. Setiap model asam amino dan glukosa dilarutkan dalam buffer fosfat 0.1 M pH 5.5 sebanyak 100 ml.
Kemudian dilakukan pemanasan dengan hot plate dengan sistem refluks. Sistem model yang dibuat meliputi:
Tabel 3.1 Pembuatan model 1 Model
konsentrasi lama pemanasan
Glukosa-glisin sesuai pada moromi
65 menit Glukosa-glisin
sesuai pada moromi 2 jam 10 menit
Glukosa-glisin sesuai pada moromi
6 jam Glukosa-glisin
0.1M 2 jam
Glukosa-glisin 0.1M
6 jam Glukosa+5 jenis as.amino
sesuai pada moromi 65 menit
Kemudian dibuat lagi sistem model dengan menggunakan variasi macam asam amino untuk mengetahui asam amino yang lebih berperan dalam aktivitas antioksidan.
Tabel 3.2 Pembuatan model 2 Model
Konsentrasi Lama pemanasan
Glukosa-glisin sesuai pada moromi
65 menit Glukosa-isoleusin
sesuai pada moromi 65 menit
Glukosa-phenilalanin sesuai pada moromi
65 menit Glukosa-tirosin
sesuai pada moromi 65 menit
Glukosa-isoleusin-phenilalanin sesuai pada moromi
65 menit Glukosa-glisin-phenilalanin
sesuai pada moromi 65 menit
Glukosa-phenilalanin-isoleusin- tirosin
sesuai pada moromi 65 menit
Glukosa-glisin-sistein sesuai pada moromi
65 menit Glukosa-sistein-phenilalanin
sesuai pada moromi 65 menit
Glukosa-glisin-sistein-phenilalanin sesuai pada moromi
65 menit
Selanjutnya dibuat sistem model yang terakhir menggunakan lama pemanasan 65 menit dan konsentrasi glukosa dan asam amino yang telah disebutkan di atas
Tabel 3.3 Pembuatan model 3 Model
Konsentrasi lama pemanasan
Glukosa – glisin - sistein sesuai pada moromi
65 menit Glukosa – glisin – sistein –
phenilalanin sesuai pada moromi
65 menit Glukosa-glisin-sistein-phenilalanin-
isoleusin-tirosin sesuai pada moromi
65 menit
Pada model 3 setelah pemanasan langsung didinginkan dengan segera disimpan dalam lemari pendingin. Setelah dingin dilakukan fraksinasi dengan ultrafiltrasi
dengan menggunakan membran 100 kDa, 30 kDa dan 10 kDa. Hasil ultrafiltrasi ini didapatkan 4 fraksi, yaitu:
Fraksi 1 F1 : BM 100 kDa Fraksi 2 F2 : BM 30 – 100 kDa
Fraksi 3 F3 : BM 10 – 30 kDa Fraksi 4 F4 : BM 10 kDa
Kemudian setiap fraksi dilakukan pengamatan terhadap serapan uv-vis dan kemampuannya sebagai antioksidan dengan metode rancimat, DPPH dan
linoleat-tiosianat. Alur penelitian model 3: glu-gli-sis, glu-gli-sis-phe dan glu-gli- sis-phe-iso-tir G-5.AA dapat dilihat pada Gambar 3.4.
Karakterisasi Kimia pada Produk M, MP, KGM, KGP
Karakterisasi kimia dilakukan dengan menganalisis kandungan air, protein, pH, total padatan terlarut, gula pereduksi, lemak dan asam amino pada produk
M, MP, KGM dan KGP, dan pengukuran terhadap kadar gula sukrosa, fruktosa dan glukosa pada gula merah dan gula pasir serta karakterisasi terhadap
kandungan protein, α
-amino nitrogen, total fenol, total padatan, pH, serapan UV-Vis dan IR pada tiap fraksi dari tiap produk mengikuti prosedur analisis
sebagai berikut.
Gambar 3.4. Skema proses pembuatan model 3 dan uji aktivitas antioksidan Glukosa-glisin-sistein
Glukosa-Glisin-Sistein- Phenilalanin-Isoleusin-Tirosin
Glukosa-Glisin-Sistein-Phenilalanin
Fraksinasi dengan stirred cell ultrafiltration
Fraksi : - BM 100 kDa F1 - 30 kDa BM 100 kDa F2
- 10 kDa BM 30 kDa F3 - BM 10 kDa F4
- Pengamatan serapan UV-Vis - Pengujian aktivitas antioksidan dengan:Rancimat, DPPH, tiosianat
- Pengujian penghambatan terhadap Hemolisis sel eritrosit manusia Dilarutkan dalam buffer fosfat 0.1 M pH 5.5
Pemanasan selama 65 menit pada suhu 100
o
C
Pendinginan
model: Glu-gli-sis model:
Glu – 5.AA
model: Glu-Gli-Sis-Phe
Penentuan Kadar Sukrosa, Fruktosa dan Glukosa
Penentuan kadar sukrosa, fruktosa dan glukosa dilakukan pada gula merah dan gula pasir. Pada gula merah dan gula pasir terlebih dahulu dilakukan
preparasi sebagai berikut: gula merah dan gula pasir masing-amsing sebanyak 10 g ditambahkan pada aquades 50 ml dan CaCO
3
3 g, kemudian dipanaskan 80
o
C selama 30 menit. Pb-acetat jenuh ditambahkan sampai endapan yang terbentuk hilang. Aliquot ditera 100 ml dan disaring dengan Whatman No.42.
Kemudian ditambahkan Na-oksalat 3 g dan disaring lagi dengan Whatman No 42. Sampel siap diinjeksikan pada HPLC. Kondisi HPLC sebagai berikut: kolom
aminex, flow rate 0.4 mlmin, eluent H
2
SO
4
0.05 M, tekanan 125 Kg Fcm2 dan panjang gelombang 325 nm
Analisis Gula Pereduksi dengan metode Lane-eynon Apriyantono et al
. 1989
Pada masing-masing produk M, MP, KGM dan KGP diambil sebanyak 10 ml dan ditambahkan larutan Fehling 10 ml sudah distandarisasi. Kemudian
ditambahkan larutan dekstrosa standar 5 ml. Campuran ini dititrasi dengan dekstrosa standar dan ditambahkan metilen biru. Penentuan persentase gula
reduksi didapatkan dari dekstrosa sebagai titer penetapan larutan standar, blanko dan sampel
Komposisi Asam Amino
Analisis komposisi asam amino menggunakan High performance Liquid
Chromatography HPLC. Penyiapan sampel dilakukan dengan menambahkan
HCl 6 N 5 ml pada produk M, MP, KGM dan KGP sebanyak 0.25 g kemudian dipanaskan pada suhu 100
o
C selama 20 jam selanjutnya dilakukan pengenceran 10 kali dengan aquades dan penyaringan. Sampel yang sudah
mengalami pemanasan dan penyaringan ini diambil 30 µ
l untuk didinginkan selama 20 menit dan kemudian ditambahkan Na-acetat sebanyak 20 ml. Sampel
siap diinjeksikan pada HPLC. Kondisi HPLC sebagai berikut: kolom yang digunakan pico Tag 3.9 X 150 nm dengan flow rate 2 mlmin dan tekanan 3000
psi dengan fase gerak asetonitril 60, buffer natrium asetat pH 5.75, detektor UV, panjang gelombang 254 nm dan volume injeksi 2
µ l.
Penghitungan persen asam amino dalam sampel :
asam amino = luas area sampel x 5 µ
g x BM x 10 x 100 luas area standar as.amino 250.000
Kadar protein dengan metode Lowry Lowry et al
1951 Analisa ini mekanismenya merupakan reaksi antara Cu
2+
dengan ikatan peptida dari sampel serta reduksi dari asam fosfomolobdat dan asam
fosfotungstat oleh tirosin dan dan triptofan yang menghasilkan warna biru. Analisis dilakukan dengan mengambil masing-masing fraksi tiap produk M, MP,
KGM dan KGP sebanyak 2 ml ditambah aquades 2 ml serta 5,5 ml pereaksi berupa campuran larutan natrium karbonat 2 dalam larutan NaOH 0,1 N dan
tembaga sulfat 0,5 dalam larutan Na-K tartarat 1 50:1, kemudian dilakukan pengadukan dan dibiarkan selama 10-15 menit pada suhu kamar. Selanjutnya
dilakukan penambahan 0,5 ml pereaksi Folin-Ciocalteau, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk. Absorbansi diukur pada panjang
gelombang 650 nm. Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan bovine serum albumin 0,25 mgml.
Kadar
α αα
α
-Amino Nitrogen Adler-Niesen 1979
Analisa ini bertujuan untuk menentukan kadar α
-amino dengan menggunakan pereaksi TNBS
trinitrobenzene sulfonic acid . Pada pH 8, asam
trinitrobenzensulfonat bereaksi dengan gugus alfa amino bebas`menghasilkan senyawa berwarna. Analisis dilakukan dengan mengambil fraksi-fraksi tiap
produk M, MP, KGM dan KGP sebanyak 0,1 ml dan volume ditepatkan menjadi 1 ml menggunakan buffer fosfat pH 8,2. Kemudian ditambahkan 1 ml larutan
TNBS 0,1, dilakukan pengadukan dan direndam dalam penangas air pada suhu 40
o
C selama 2 jam dalam tabung reaksi yang tertutup semua. Reaksi dihentikan dengan cara menambahkan 1ml HCl 1 N, kemudian diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 340 nm. Kurva standar dibuat dengan larutan leusin 10 mgml.
Kadar Total Fenol Shetty 1999
Analisis dilakukan dengan mengambil fraksi-fraksi tiap produk M, MP, KGM dan KGP sebanyak 1ml dan ditambahkan 1 ml etanol 95 serta aquades 5 ml.
Kemudian ditambahkan 0.5 ml Folin Ciocalteau 50 dan ditunggu selama 5 menit, baru kemudian ditambahkan Na
2
CO
3
5 sebanyak 1 ml dicampur dengan menggunakan vortex. Setelah itu diinkubasikan dalam ruangan gelap selama 30
menit. Dilakukan vortex lagi dan kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 725 nm. Kurva standar dibuat dengan larutan asam tanat
Absorbsi UV-Vis
Pengukuran absorbsi UV-Vis menggunakan spektrofotometer Shimadzu UV-160 dilakukan pada tiap fraksi dari tiap produk M, MP, KGM dan KGP serta
model dengan kisaran panjang gelombang 200 – 500 nm. Hal ini bertujuan untuk memberikan dugaan senyawa-senyawa yang dominan dalam tiap fraksi.
Pengukuran absorbansi dilakukan dengan mengambil 1 ml tiap fraksi dengan pengenceran sebanyak lima kali untuk mendapatkan spektrum yang jelas.
Spectra IR
Identifikasi gugus fungsional tiap fraksi dengan Fourier Transformation Infra
Red FTIR. Pada masing-masing fraksi tiap produk dicampur dengan KBr
dengan perbandingan 1100 untuk dibentuk menjadi pelet, kemudian pelet ini dianalisis dengan FTIR BIORAD Excalibur series dengan kisaran bilangan
gelombang 400-4000 cm
-1
Pemisahan senyawa yang terdapat dalam tiap fraksi Arnoldi
et al 1997 dan
Kurata et al
1973 Pada fraksi F1 dan F4 tiap produk M, MP, KGM dan KGP diteteskan pada
lempeng TLC thin layer chromatografi
secukupnya menggunakan pipa kapiler dan dibiarkan kering. Kemudian di elusi menggunakan berbagai komposisi
pelarut, hal ini bertujuan untuk mendapatkan spot pemisahan yang paling baik. Komposisi pelarut yang digunakan sebagai berikut : khloroform:etil asetat:etanol
15:2:2; 5:2:2; 1:2:2 dan butanol:etanol:H
2
O:asam asetat 50:20:30:1; 30:20:30:20; 20:20:30:1; 20:30:30:30; 20:20:10:20; 10:20:20:10; 10:30:30:30;
serta pelarut etil asetat:pyridine:H
2
O 10:4:3; 8:4:3 dan ditunggu sampai fase bergerak mencapai sekitar 2 cm dari pinggir atas TLC. Setelah kering lempeng
TLC diamati spot yang terbentuk. Spot yang didapat dideteksi di bawah sinar ultraviolet dengan panjang gelombang 254 nm. Hasil pemisahan yang didapat
dibandingkan dengan literatur. Selanjutnya spot yang dihasilkan oleh fraksi-fraksi yang dilewatkan pada
TLC dilakukan pengerokan dan dilarutkan kembali ke dalam pelarut kemudian diinjeksikan pada HPLC. Kondisi HPLC sebagai berikut: kolom yang digunakan
C-18 dengan flow rate 1 mlmin dan tekanan 3000 psi dengan eluent metanol, detektor UV, panjang gelombang 420-460 nm dan volume injeksi 2
µ l.
Analisis antioksidan dengan rancimat
Minyak kedelai sebanyak 10 ml dan ditambahkan 1 ml fraksi-fraksi dari tiap produk M, MP, KGM, KGP dan model sebanyak 1 ml diaduk dengan
ditambahkan tween 80 agar tercampur secara homogen. Minyak kedelai yang sudah ada sampelnya ini diambil sebanyak 3 g dan dimasukkan dalam tabung
rancimat dan dihubungkan pada aliran udara dengan menggunakan suhu sekitar 110
o
C. Produk oksidasinya ditransfer untuk diukur dan demikian juga absorbsinya dalam air destilat. Nilai konduktivitas sebagai produk sekunder dari
oksidasi lipida dari pengukuran ini akan muncul kurva oksidasi yang diperoleh dari perubahan waktu induksi. Hal ini merupakan nilai karakteristik dari stabilitas
oksidasi. Efisiensi
antioksidan indeks
protektif dinyatakan
sebagai perbandingan waktu induksi lipida mengandung antioksidan terhadap waktu
induksi lipida tanpa antioksidan. Hasil ini juga dibandingkan dengan antioksidan BHT.
Indek protektif = Waktu induksi fraksi Waktu induksi kontrol
Analisis antioksidan dengan penetapan bilangan TBA Bedinghaus 1995
Sebanyak 5 ml fraksi tiap produk M, MP, KGM, KGP dan 5 ml TBA t
hiobarbituric acid 0.02 M ditempatkan dalam tabung reaksi tertutup. Kemudian
dilakukan pengocokan sebanyak tiga kali dan setelah itu didiamkan dalam ruangan gelap pada suhu ruang selama 15 jam. Pengukuran absorbansi
dilakukan pada panjang gelombang 530 nm. Nilai absorbansi yang didapat dikalikan dengan nilai K dari kurva standar.
Nilai K = SA MW 107SW100P Keterangan :
SA = slope dari kurva standar 6.195 x 10-8 MW = berat molekul dari malonaldehid 72,03
SW = berat sampel yang dianalisis P = recovery yang ditambah standar 1,1,3,3-tetramethoxypropane
TMP.
Analisis antioksidan dengan radikal DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
Cheung et al
2003 Sebanyak 1 ml fraksi tiap produk M, MP, KGM, KGP dan model
ditambahkan 0.5 ml DPPH dalam metanol 0.1 mM di vortex, kemudian segera ditentukan absorbannya pada panjang gelombang 520 nm
Aktivitas antioksidan = 1 – Absorbansi fraksi x 100 Absorbansi blanko
Uji Fe III thiosianat Tressl Wondrak, 1998
Sebanyak 2 µ
l fraksi tiap produk M, MP, KGM, KGP dan model dalam 2 ml etanol 99.5 ditambahkan pada 2.052 ml asam linoleat 2.51 dalam 99.5
etanol, 4 ml buffer fosfat 0.05 M, pH 7 dan 1.948 ml air destilat. Kemudian ditempatkan pada waterbath 40
o
C selama satu minggu. Tiap 24 jam aliquot diambil 0.1 ml dan ditambahkan pada 9.7 ml etanol 75 vv dan 0.1 ml
NH
4
SCN 30 wv, dikocok dan kemudian ditambahkan 0.1 ml FeCl
2
0.02 M dalam HCl 3.55. Didiamkan selama 3 menit dan diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 500 nm Aktivitas antioksidan = 1 – Absorbansi fraksi x 100
Absorbansi blanko
Pengujian Aktivitas Antioksidan dalam Sistem Biologi Menggunakan Sel Eritrosit sebagai Model
a.Isolasi sel eritrosit manusia Nike et al
1988 dan Zhu 2002
Pengujian aktivitas antioksidan ini dilakukan secara in vitro.
Darah diambil dari donor sehat berjenis kelamin laki-laki dan pengambilan dilakukan secara
aseptis kurang lebih sebanyak 30 ml dimasukkan dalam tabung vacuntee
steril yang sudah mengandung antikoagulan CPDA 0.1
citrate phosphate dextrose adenin
. Darah tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse steril dan pengerjaannya dilakukan dalam
laminar hood selanjutnya disentrifuse
dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Sel eritrosit yang mengendap di bawah dicuci dengan menggunakan PBS
phosphat buffer saline lima kali volume sel eritrosit yang diambil. Kemudian sebanyak 1 ml sel eritrosit dicuci dengan 5 ml larutan PBS kemudian disentrifuse
dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Sel eritrosit akan mengendap di dasar tabung dan larutan PBS akan berwarna kuning jernih. Suspensi eritrosit
kemudian diencerkan agar jumlah sel dapat dihitung dan sel yang hidup harus lebih dari 95
Sel darah meraheritrosit
b. Penghitungan jumlah sel eritrosit manusia Jumlah sel eritrosit yang ada dalam suspensi dihitung menggunakan
hemasitometer . Sebanyak 100 µl suspensi eritrosit hasil pencucian dengan PBS
dari prosedur isolasi di atas diambil lalu ditambah dengan PBS lagi sebanyak 1400 µl. Dari suspensi sel eritrosit ini diambil 100 µl lalu ditambah 1400 µl PBS.
Kemudian diambil 25 µl suspensi sel eritrosit dicampur dengan biru triphan 0.2 diaduk dan ditempatkan pada hemasitometer. Larutan pewarna biru triphan
dibuat dengan melarutkan 20 mg bubuk biru triphan dalam 10 ml air bebas ion. Kemudian campuran sel eritrosit dan biru triphan ini dilihat di bawah mikroskop
dengan perbesaran total 400 kali. Sel yang hidup akan berwarna jernih pada dinding selnya, sedangkan sel yang mati terlihat biru seluruhnya. Jumlah sel
yang hidupdihitung dan penghitungannya dilakukan dalam waktu kurang dari 3 menit, untuk mencegah adanya penyerapan warna oleh sel hidup karena adanya
afinitas yang kuat dari biru triphan pada DNA. Rumus perhitungan sel eritrosit dengan menggunakan hemasitometer
adalah sebagai berikut: N = A x FP x 10
4
selml N = jumlah sel per mililiter
A = rata-rata jumlah sel terhitung FP = Faktor pengenceran penambahan 50 µl biru triphan dan 50 µl suspensi
sel
c. Uji terhadap hemolisis eritrosit manusia
Pada pengujian penghambatan hemolisis sel eritrosit ini digunakan sampel dari: 1. Kecap manis KGP: F1 BM100 kDa dan F4 BM10kDa
2. Model G-5.AA: F1 BM100 kDa dan F4 BM10kDa Konsentrasi H
2
O
2
yang digunakan untuk oksidator adalah 3.3 mM Dewi 2008 dan metode analisis dengan menggunakan metode sentrifugasi tunggal Dewi
2008. Pengujian dengan menggunakan oksidator H
2
O
2
dan tanpa H
2
O
2
. Disiapkan 1 set tabung eppendorf dengan masing-masing fraksi yang akan diuji
dan duplo. Volume akhir suspensi yang digunakan untuk tiap eppendorf adalah 800 µl. Suspensi sel eritrosit stok dengan konsentrasi 20x10
7
selml. Suspensi sel sebanyak 160 µl dimasukkan dalam tabung eppendorf kemudian
ditambahkan fraksi-fraksi yang akan diuji sebanyak 160 µl. Selanjutnya ditambahkan larutan H
2
O
2
stok sebanyak 160 µl, inkubasi di inkubator bersuhu 37
o
C dengan CO
2
5 hingga waktu pengamatan dari jam ke-0 sampai jam ke-5. Untuk lebih jelasnya rincian volume masing-masing perlakuan dapat dilihat Tabel
3.1-3.2 Tabel 3.4 Pengujian penghambatan hemolisis dengan oksidator H
2
O
2
Jenis fraksi Volume µl
fraksi sel eritrosit
H
2
O
2
PBS kontrol
- 160
160 480
KGP100kDa 160
160 160
320 KGP10 kDa
160 160
160 320
G-5.AA100kDa 160
160 160
320 G-5.AA10kDa
160 160
160 320
Ket: KGP:kecap manis dengan gula pasir; G-5.AA: glukosa dengan glisin,sistein,phenilalanin,isoleusin,tirosin
PBS: fosfat buffer saline
Tabel 3.5 Pengujian penghambatan hemolisis tanpa oksidator H
2
O
2
Jenis fraksi Volume µl
fraksi sel eritrosit
PBS kontrol
160 640
KGP100kDa 160
160 480
KGP10 kDa 160
160 480
G-5.AA100kDa 160
160 480
G-5.AA10kDa 160
160 480
Ket: KGP:kecap manis dengan gula pasir; G-5.AA: glukosa dengan glisin,sistein,phenilalanin,isoleusin,tirosin
PBS: fosfat buffer saline
Pengamatan dimulai dengan mengambil 1 set eppendorf untuk disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan
sel darah merah. Sebanyak 150 µl supernatan diambil dan dimasukkan ke 96- well plate dan diukur absorbansinya dengan menggunakan
spectrofotometer microplate reader
pada panjang gelombang 450 nm. Pada pengamatan jam ke-5 dilakukan penghitungan sel yang hidup dengan metode pewarnaan biru trifan.
Pencegahan hemolisis = abs.kontrol – abs. Sampel X 100 abs.kontrol
Keterangan: Abs.kontrol : absorbansi suspensi eritrosit + oksidator H
2
O
2
Abs. Sampel : absorbansi suspensi eritrosit + fraksi sampel + oksidator – absorbansi fraksi sampel
Untuk pengujian yang tanpa menggunakan oksidator H
2
O
2
maka perhitungan persen penghambatan hemolisis tanpa menggunakan absorbansi oksidator H
2
O
2
Analisis Statistik
Rancangan percobaan yang dipergunakan untuk mengetahui karakteristik kimia dan aktivitas antioksidan antar fraksi-fraksi pada moromi dan kecap manis
adalah rancangan acak lengkap bentuk faktorial. Model liniernya adalah:
Y = µ + A
i
+ B
j
+ AB
ij
+
ijn
Dimana: Y : Respon percobaan terhadap pengaruh jenis perlakuan M, MP, KGM,
KGP dan jenis fraksi pada ulangan ke-n µ : rata-rata umum
A
i
: Pengaruh perlakuan A jenis kecap pada taraf ke-i B
j
: Pengaruh perlakuan B jenis fraksi pada taraf ke-j AB
ij
:Pengaruh interaksi pelakuan A dan perlakuan B
ijn
: Pengaruh kesalahan percobaan pada ulangan ke-n karena pengaruh A
i
, B
j
dan AB
ij
Multiple comparison dilakukan dengan menggunakan
one way analysis of variance
ANOVA dimana nilai p0.05 dianggap signifikan secara statistik dilanjutkan dengan uji Duncan.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN