Waktu dan Tempat Bahan Metode Penelitian Analisis Data Tipe Pertumbuhan Kultur

BAB 3 BAHAN DAN METODA

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli sampai dengan Oktober 2007 di Laboratorium Kultur Jaringan Unit Pelaksana Teknis Balai Benih Induk Dinas Pertanian Sumatera Utara.

3.2. Bahan

Bahan yang digunakan sebagai eksplan adalah jantung pisang barangan Musa acuminata L.. Bahan ini diambil dari Desa Telun Kenas, kecamatan Deli Tua Kabupaten Deliserdang, Sumatera Utara.

3.3. Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode percobaan Rancangan Acak Lengkap RAL faktorial dengan 2 faktor, yaitu: I. Faktor Konsentrasi BAP B Terdiri 4 taraf yaitu B B = 0 mgl 1 B = 2.5 mgl 2 B = 3.75 mgl 3 = 5.0 mgl II. Faktor Konsentrasi NAA N Terdiri 4 taraf yaitu N N = 0 mgl 1 N = 0.5 mgl 2 N = 1 mgl 3 Sehingga diperoleh 16 kombinasi perlakuan, yaitu: = 1.5 mgl B N B 1 N B 2 N B 3 N B N 1 B 1 N 1 B 2 N 1 B 3 N 1 B N 2 B 1 N 2 B 2 N 2 B 3 N B 2 N 3 B 1 N 3 B 2 N 3 B 3 N 3 Dengan jumlah ulangan pada setiap perlakuan 5, maka jumlah botol percobaan seluruhnya adalah 80 satuan percobaan. Lay out percobaan dapat dilihat pada lampiran E. 3.4. Pelaksanaan Penelitian 3.4.1. Sterilisasi Alat Sterilisasi dimaksudkan agar seluruh alat yang digunakan terbebas dari kontaminasi. Semua alat-alat gelas dicuci dengan detergen sampai bersih dan dikeringkan. Cawan petri diisi dengan kertas saring. Kemudian cawan petri tersebut, beserta dengan pinset, pisau dan batang pengaduk dibungkus dengan kertas dan disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 121 C dan dengan tekanan 15 psi selama 60 menit. Dalam sterilisasi ini juga diikutsertakan akuades dalam erlenmeyer yang telah ditutup dengan aluminium foil Hartmann et al, 1983, hlm. 601.

3.4.2. Pembuatan Media

Media yang digunakan adalah media MS Murashige dan Skoog padat, dengan komposisi seperti terlihat pada lampiran F. Media ini ditambah BAP dan NAA dengan konsentrasi sesuai dengan perlakuan. Untuk mempermudah pembuatan media maka bahan-bahan yang dipergunakan dibuat dalam larutan stok. Larutan stok yang diperlukan adalah hara mikro, vitamin dan zat pengatur tumbuh, sementara unsur hara makro, myo-inositol, sukrosa dan agar dapat ditimbang langsung sesuai dengan kebutuhan. Media yang digunakan sebanyak 5 l sehingga setiap hara makro, mikro, myo- inositol, sukrosa, vitamin dan iron dibuat untuk media dengan ukuran 5 l. Larutan MS dibuat penuh dengan cara memasukkan hara makro, myo-inositol dan sukrosa ke dalam gelas ukur 1000 ml yang terlebih dahulu diisi dengan akuades. Ke dalam akuades tersebut dimasukkan unsur hara mikro, iron, vitamin masing-masing 5 ml dari larutan stok dan kemudian dipenuhkan menjadi 5 l. Larutan dibagi menjadi 16 bagian sesuai dengan perlakuan. Setiap bagian diberi BAP dan NAA sesuai dengan perlakuan. Derajat keasaman pH larutan diukur dengan menggunakan pH meter dengan pH 5.8. Untuk mendapatkan pH yang diinginkan ditambahkan NaOH 0.1 N atau HCl 0.1 N. Agar ditambahkan sebagai pemadat media dan dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya media dituang ke dalam botol kultur yang telah diberi label sesuai perlakuan dan banyaknya ulangan, setiap botol ulangan berisi ± 40 ml media kemudian ditutup dengan aluminium foil dan diikat dengan karet gelang. Media dalam botol tersebut kemudian disterilisasi dengan autoklaf bersuhu 121 C dan bertekanan 15 psi selama 30 menit. Botol kultur ditempatkan di rak-rak kultur untuk menghindari kontaminasi Reinert and Bajaj, 1989, hlm. 184.

3.4.3. Sterilisasi Bahan

Bahan berupa bunga jantung pisang barangan dikupas seperti pada terlihat pada Gambar 3.1 Halaman 17, pelepah-pelepah dibuang sampai didapatkan jantung dengan ukuran kecil kira-kira 10 cm seperti pada Gambar 3.2 Halaman 17, jantung dicuci dengan detergen. Eksplan diperkecil lagi dengan cara memotong eksplan dengan pisau dibawah air mengalir. Eksplan direndam dalam larutan Dithane M-45 2 gl yang ditambahkan dengan 2 tetes Tween 80 selama 1.5 jam dan diguncang dengan shaker. Eksplan lalu dicuci dengan air mengalir sampai bersih, disemprot dengan alkohol 96 kira-kira 3 menit, dicuci kembali dibawah air mengalir selanjutnya direndam kembali dalam larutan kloroks 20 ditambah 2 tetes Tween 80 dan diguncang selama 20 menit. Ekspan dibilas dengan akuades steril sebanyak 3 kali, direndam dalam larutan kloroks 10 dan diguncang selama 10 menit. Eksplan dicuci dengan akuades steril sebanyak 3 kali. Selanjutnya eksplan diperkecil kembali dengan pisau di atas cawan petri steril tanpa membuang bagian pedunculus dari jantung tersebut sehingga didapatkan eksplan seperti pada Gambar 3.3 Halaman 18. Direndam dalam larutan asam askorbat 2 gl selama 30 menit. Eksplan dicuci dengan aquades steril sampai bersih. Pekerjaan ini dilakukan di Laminar Air Flow Cabinet LAFC Unit Pelaksana Teknis Balai Benih Induk, 2007. Gambar 3.1 Jantung pisang barangan Gambar 3.2 Jantung pisang barangan yang telah dikupas 3.4.4. Penanaman Eksplan Satu hari sebelum penanaman diupayakan supaya ruangan dalam keadaan bersih dan telah dipel dengan cairan desinfektan dan lampu UV dalam LAFC juga dihidupkan. Sebelum penanaman dipersiapkan terlebih dahulu alat-alat yang akan digunakan yaitu pinset dan pisau steril yang direndam dalam alkohol 96, bunsen dan alkohol 70. Eksplan Gambar 3.4 Halaman 18 yang telah disterilkan ditanam satu per satu ke dalam media dengan menggunakan pinset steril. Setiap botol media hanya diisi oleh satu eksplan seperti pada Gambar 3.5 Halaman 18. Setiap kali mengambil eksplan dengan pinset terlebih dahulu dicelupkan ke dalam alkohol 96 lalu dibakar. Botol berisi eksplan kemudian ditutup dengan aluminium foil dan diikat dengan karet gelang. Gambar 3.3 Pemotongan eksplan Gambar 3.4 Eksplan siap ditanam Gambar 3.5 Eksplan dalam media 3.4.5. Pemeliharaan Botol-botol kultur yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak kultur sesuai dengan lay out penelitian di dalam ruang kultur. Ruang pemeliharaan harus senantiasa bersih dan disemprot dengan alkohol 70 setiap hari. Suhu dijaga berkisar 25 o ±2 o C dengan pengaturan AC. Pada rak kultur intensitas cahaya dengan penyinaran lampu neon 500 lux.

3.4.6. Variabel Pengamatan

Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah: 1. Tipe Pertumbuhan Kultur Tipe pertumbuhan kultur menunjukkan tipe regenerasi pada eksplan. 2. Saat Inisiasi HST Saat inisiasi kultur menunjukkan saat terbentuk tunas. Dihitung mulai awal penanaman eksplan sampai terbentuk tonjolan tunas. 3. Jumlah Tunas buah Jumlah tunas yang terbentuk dihitung dengan pengamatan visual di akhir penelitian 4. Berat Basah kultur g Berat kultur ditimbang dengan timbangan analitik pada akhir penelitian. Eksplan dikeluarkan dari media, dibersihkan dari sisa-sisa media kemudian ditimbang. 5. Persentase kultur yang terkontaminasi Persentase kultur yang terkontaminasi dihitung setiap hari sejak awal hingga akhir penelitian dengan rumus: Jumlah eksplan yang terkontaminasi Persentase terkontaminasi = X 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan

3.5. Analisis Data

Model analisis data yang digunakan adalah dengan menggunakan Analysis of Variance ANOVA. Kalau terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan Duncan New Multiple Range Test DMRT Sastrosupadi, 2000. BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Tipe Pertumbuhan Kultur

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan diperoleh data tipe pertumbuhan kultur pada seluruh perlakuan yang dapat dilihat pada Tabel 4.1 berikut ini: Tabel 4.1 Tipe Pertumbuhan Kultur Perlakuan Ulangan 1 2 3 4 5 B N T T T T T B N - 1 T T T T B N T 2 T T T - B N T 3 T - T T B 1 N - T T T T B 1 N T 1 T T - - B 1 N T 2 T T T T B 1 N T 3 T T T T B 2 N T T T T T B 2 N T 1 - T - - B 2 N - 2 - T - B 2 N T 3 T T T B 3 N T T T T - B 3 N T 1 T T T - B 3 N T 2 T T T T B 3 N T 3 T T - - Keterangan: Jumlah T = Tunas 62 - = Kontaminasi 16 0 = Tidak tumbuh 2 Semua kombinasi perlakuan memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan tunas tetapi tidak menumbuhkan daun, akar dan kalus. Dari pengamatan secara visual dapat dilihat bahwa tunas biasanya muncul dari bagian pedunculus bunga yang diawali dengan terbentuknya tonjolan tunas yang akan berkembang menjadi tunas. Pada perlakuan B 2 3.75 mgl BAP merupakan perlakuan dengan jumlah kultur yang membentuk tunas yang paling rendah. Katuuk 1998 dalam Sofia 2007 mengatakan bahwa keseimbangan auksin dan sitokinin eksogen menentukan dalam pembentukan jumlah tunas. Ada kalanya pembentukan tunas dapat berlangsung tanpa memberikan salah satu dari kedua zat pengatur tumbuh ini. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian yang menunjukkan bahwa perlakuan tanpa BAP dan NAA dapat menumbuhkan tunas. Dari setiap perlakuan juga tidak ditemukan adanya pembentukan kalus, hal ini mungkin disebabkan karena konsentrasi BAP yang tidak sesuai untuk pertumbuhan kalus. Keseimbangan antara auksin endogen dalam eksplan dengan sitokinin endogen, maupun sitokinin eksogen yang diberikan akan mempengaruhi proses pertumbuhan eksplan itu sendiri. Konsentrasi BAP yang rendah berpengaruh baik pada pembentukan tunas Sofia, 2007. Dari pendapat ini dapat diduga bahwa konsentrasi BAP kurang tinggi untuk dapat menginduksi kalus. Tidak tumbuhnya kalus ini juga mungkin disebabkan karena eksplan yang tidak dapat membentuk kalus karena tidak sesuai dengan media yang diberikan. Menurut Santoso dan Nursandi 2004, hlm 63, bahwa teknik kultur jaringan menekankan lingkungan media yang cocok agar eksplan dapat tumbuh dan berkembang. Kebutuhan tiap tanaman berbeda pada hal komposisi dan jumlah yang diperlukan. Eksplan yang tidak tumbuh dapat disebabkan karena tidak responsif terhadap pemberian zat pengatur tumbuh pada media atau sterilisasi yang berlebihan.

4.2 Inisiasi kultur