Uji Identifikasi menggunakan Spektrofotometer FTIR Hasil uji validasi

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Uji Identifikasi menggunakan Spektrofotometer FTIR

Baku kloramfenikol yang diperoleh dari PT. Universal sebelum digunakan sebagai baku pembanding terlebih dahulu diidentifikasi menggunakan Spektrofotometer FTIR pada rentang bilangan gelombang 4000 – 500 cm -1 . Spektrum Inframerah kloramfenikol dapat dilihat pada gambar 1 bawah ini: Gambar 1. Spektrum Inframerah Kloramfenikol baku PT. Universal Dari hasil pengukuran diperoleh bentuk spektrum kloramfenikol baku PT. Universal sama dengan bentuk spektrum baku pembanding kloramfenikol BPFI. Pada daerah sidik jari didapat bilangan gelombang yang hampir sama dengan bilangan gelombang yang terdapat di dalam literatur yaitu 1681, 847, 1072, 1515, 816, 1562 cm -1 Clarke’s. Universitas Sumatera Utara Pada daerah gugus fungsi, terdapat bilangan gelombang 3342,64 cm -1 ini menunjukkan adanya gugus OH dan pada 3477,66 cm -1 adanya gugus amin sekunder dan pada 3080,32 cm -1 terdapatnya stretching CH aromatis. Dari data spektrum yang diperoleh dapat diambil kesimpulan baku yang diidentifikasi adalah kloramfenikol.

4.2 Uji Kualitatif dan Kuantitatif Kloramfenikol menggunakan KCKT

Uji identifikasi pada awalnya dilakukan dengan menggunakan fase gerak dan laju alir yang sesuai menurut Farmakope Indonesia edisi IV 1995, dengan kolom yang sama yaitu C18 tetapi berbeda dalam ukuran kolom. Kromatogram hasil identifikasi dapat dilihat pada gambar 2. Gambar 2. Kromatogram hasil penyuntikan larutan kloramfenikol BPFI dengan konsentrasi 125 mcgml, fase gerak Air-Metanol-Asam asetat glasial 55 : 45 : 0,1. Pada gambar diatas terlihat dari hasil penyuntikan kloramfenikol baku pembanding BPFI diperoleh dua kromatogram. Ini kemungkinan disebabkan Universitas Sumatera Utara kolom yang kotor. Untuk mengatasi hal ini telah dilakukan pencucian kolom, ternyata juga memberikan hasil yang sama. . Menurut Connors 1992. Kloramfenikol dalam larutan air pada suhu kamar peka terhadap reaksi fotodegradasi, mudah terhidrolisa dan stabil pada pH 2 sampai 7. Dapat diambil kesimpulan terdapatnya kromatogram selain dari kromatogram kloramfenikol, kemungkinan ini disebabkan larutan kloramfenikol telah terhidrolisa, maka untuk mengatasi hal ini fase gerak air diganti dengan buffer Gifford pada pH 6. Kromatogram hasil percobaan dapat dilihat pada gambar 3. Gambar 3. Kromatogram hasil penyuntikan larutan kloramfenikol BPFI dengan konsentrasi 125 mcgml, fase gerak buffer Gifford pH 6-Metanol- Asam asetat glasial 55 : 45 : 0,1. Dari gambar diatas diperoleh satu kromatogram yang merupakan kromatogram dari kloramfenikol baku pembanding dengan waktu retensi 8,316 menit. Universitas Sumatera Utara

4.2.1 Penentuan perbandingan fase gerak

Untuk mengetahui perbandingan fase gerak, waktu tambat dan tekanan kolom pada kondisi yang optimum, maka terlebih dahulu dilakukan orientasi perbandingan fase gerak. Orientasi dilakukan dengan cara menyuntikkan larutan 125 mcgml Kloramfenikol baku pembanding ke dalam sistem KCKT dengan variasi perbandingan fase gerak buffer Gifford pH 6-Metanol-Asam asetat glasial dengan perbandingan 55 : 45 : 0,1, 45 : 55 : 0,1 dan 65 : 35 : 0,1, dideteksi pada panjang gelombang 280 nm, dengan laju alir 1 mlmenit dan 1,5 mlmenit. Dicatat waktu tambat, theoritical plate dan tailing factor. Hasil orientasi dapat dilihat pada tabel 1 dan gambar pada lampiran 4. Tabel 1. Hasil optimasi fase gerak dengan parameter data waktu tambat, theoretical plat dan tailing factor NO Perbandingan FaseGerak buffer Gifford pH 6- Metanol-Asam asetat glasial Laju alir mlmenit Waktu tambat menit Theoritical plate Tailing Factor 1. 55 : 45 : 0,1 1 1,5 9,370 8,316 1155,314 1265,485 3,396 3,141 2. 45 : 55 : 0,1 1 1,5 5,776 3,848 1153,342 1033,729 3,510 3,231 3. 65 : 35 : 0,1 1 1,5 17,129 11,492 1152,596 1176,452 3,494 3,246 Dari tabel diatas dapat dilihat perbandingan fase gerak yang terbaik adalah 55 : 45 : 0,1 dengan laju alir 1,5 mlmenit, meskipun waktu tambat yang diberikan relatif lebih lama 8,316 tetapi memberikan theoritical plate yang lebih besar dan tailing faktor yang relatif kecil. Selanjutnya kondisi kromatogram terpilih ini digunakan untuk identifikasi dan kuantitatif. Universitas Sumatera Utara

4.2.2 Uji Kualitatif Kloramfenikol menggunakan KCKT

Hasil uji kualitatif kloramfenikol BPFI pada penyuntikan dengan konsentrasi 125 mcgml diperoleh kromatogram dengan waktu tambat kloramfenikol 8,316 menit dapat dilihat pada gambar 4. Waktu tambat yang diperoleh dari pengujian BPFI dibandingkan dengan waktu tambat yang diperoleh sampel yang akan di analisa. Gambar 4. Kromatogram hasil penyuntikan larutan kloramfenikol BPFI dengan konsentrasi 125 mcgml, fase gerak buffer Gifford pH 6-Metanol- Asam asetat glasial 55 : 45 : 0,1. Hasil pengujian untuk sampel diperoleh waktu tambat yang hampir sama dengan Kloramfenikol BPFI. Waktu tambat rata-rata kapsul Kloramfenikol PT. Indofarma 8,429 menit, Kloramfenikol PT. Kimia farma 8,411 menit, Kloramfenikol PT. Universal 8,328 menit, Kloramfenikol PT. Kalbe farma 8,362 menit dan Kloramfenikol PT. Sanbe farma 8,529 menit. Dapat diambil kesimpulan bahwa sampel mengandung kloramfenikol. Universitas Sumatera Utara

4.2.3 Penentuan linieritas kurva kalibrasi

Penentuan linieritas kurva kalibrasi kloramfenikol BPFI ditentukan berdasarkan luas puncak pada konsentrasi 75, 100, 125, 150, 175 mcgml, diperoleh hubungan yang linier dengan koefisien korelasi r = 0,9994 dan persamaan regrasi Y = 37721, 976 X – 156851,2. Kurva kalibrasi kloramfenikol dapat dilihat pada gambar 5 dibawah ini: Gambar 5. Kurva kalibrasi kloramfenikol BPFI Universitas Sumatera Utara

4.2.4 Penetapan kadar sampel

Sesuai dengan teori yang dikemukakan oleh Snyder dan Kirland 1979 yaitu pengukuran kadar lebih baik dengan cara pengukuran luas puncak dibandingkan dengan pengukuran tinggi puncak. Maka dalam hal ini yang digunakan adalah nilai dari luas puncak. Kloramfenikol sukar larut dalam air, untuk mempermudah kelarutannya ditambahkan metanol. Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas puncak pada Y dari persamaan regresi Y = 37721, 976 X – 156851,2. Hasil perhitungan kadar setelah dilakukan uji statistik dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Data kadar Kloramfenikol dalam sediaan kapsul NO Kapsul Rentang Kadar Kloramfenikol kapsul 1. Kloramfenikol PT. Indofarma 105,2 ± 0,26 2. Kloramfenikol PT. Kimia Farma 101,01± 0,88 3. Kloramfenikol PT. Universal 94,68± 0,56 4. Kalmicetine PT. Kalbe farma 101,19± 0,76 5. Colsancetine PT. Sanbe farma 103,80± 0,93 Dari tabel diatas terlihat bahwa dari kelima sampel yang diteliti semuanya memenuhi persyaratan kadar yang tertera dalam FI edisi IV 1995. Universitas Sumatera Utara

4.3 Hasil uji validasi

Pada penelitian ini dilakukan uji validasi metode, dengan metode penambahan bahan baku Standard Addition Method terhadap sampel kapsul Kalmicetin PT. Kalbe Farma. Uji ini meliputi uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali recovery dan uji presisi dengan parameter RSD Relatif Standar Deviasi, batas deteksi LOD dan batas quantitasi LOQ. Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali dilakukan dengan membuat 3 konsentrasi analit dengan rentang spesifik 80, 100, 120, masing- masing dengan 3 replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70 analit dan 30 baku pembanding. Data hasil pengujian perolehan kembali kapsul kloramfenikol PT. Kalbe Farma dengan metode penambahan bahan baku Standar Addition Method dapat dilihat pada table 3 di bawah ini. Tabel 3. Data hasil perolehan kembali Kloramfenikol dengan metode penambahan bahan baku Standard Addition Method No Rentang Spesifik Luas area perolehan kembali 7478904 100,57 1. 80 7480168 100,62 7478140 100,52 9360617 99,32 2. 100 9362048 99,37 9365495 99,49 11293294 99,24 3. 120 11290387 99,15 11290059 99,14 Kadar rata-rata Recovery Standar Deviasi Relatif tandar Deviasi RSD 99,71 0,6519 0,6538 Universitas Sumatera Utara Dari data diatas diperoleh persen perolehan kembali kloramfenikol 99,71 dengan Relatif Standar Deviasi RSD 0,6538 . Nilai RSD yang diizinkan adalah ≤ 2 dan batas rata – rata yang diperoleh adalah 98 – 102 . Maka dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai akurasi dan presisi yang memenuhi syarat WHO, 1992. Batas deteksi LOD dan batas kuantitasi LOQ yang diperoleh dari penelitian ini sebesar 4,8337 mcgml dan 16,1123 mcgml. Universitas Sumatera Utara BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Penetapan kadar kloramfenikol dalam sediaan kapsul dapat dilakukan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menggunakan kolom C18 4,6 mm x 25 cm dengan fase gerak buffer Gifford pH 6-Metanol-Asam asetat glasial dengan perbandingan 55 : 45 : 0,1, laju alir 1,5 mlmenit, pada panjang gelombang 280 nm. Metode ini memberikan uji validasi dengan parameter akurasi dan presisi yang memenuhi syarat. Hasil penetapan kadar kloramfenikol dari kelima sampel, semuanya memenuhi persyaratan kadar yang tertera dalam FI edisi IV 1995.

5.2 Saran