SKRINING BAL UNTUK PEMBUATAN KEJU BAHAN DAN ALAT PENELITIAN METODE PENELITIAN

5 asam laktat dalam konsentrasi tinggi, kemampuannya dalam menekan pertumbuhan mikroorganisme lain, adalah keunggulannya dalam mempertahankan hidup di lingkungan yang berbeda-beda Rose 1983. Dalam pembuatan keju, BAL berperan dalam pembentukancurd karena BAL akan mengubah laktosa menjadi asam laktat sehingga pH susu akan turun. Dengan penurunan pH ini menuju pH isoelektris, kasein susu sebagai protein akan mengendap dengan memerangkap beberapa padatan susu lainnya sehingga akan terpisah antara padatan curd dan cairan whey susu Hill 2006 dalam Flores 2008. Selain itu, nilai pH rendah pada keju segar 5,0-5,2 membantu menekan pertumbuhan bakteri patogen dan bakteri pembusuk sehingga produk menjadi lebih awet. Bakteri Asam Laktat juga menghasilkan sekelumit aktivitas proteolitik dan lipolitik. Pada tingkatan yang lebih kecil, bakteri ini membantu proses pematangan keju. Karakteristik BAL yang dipilih untuk starter keju adalah yang memiliki kecepatan pertumbuhan tinggi, mampu meningkatkan keasaman, tahan terhadap bakteriofag dan antibiotik, menghasilkan senyawa- senyawa citarasa yang diharapkan, serta keseragaman produk akhir tiap kali produksi. Suhu yang biasanya digunakan untuk inkubasi kultur starter keju adalah 21,1-22,2 °C. Suhu sangat baik untuk pertumbuhan mikroorganisme kultur, tetapi mikroorganisme kontaminan pada susu pasteurisasi tidak dapat tumbuh. Suhu diatas 23,9 °C memungkinkan tumbuhnya mikroorganisme lain. Lama inkubasi tidak tergantung dari tinggi rendahnya suhu inkubasi yang digunakan. Namun, bergantung pada jumlah inokulum yang diinokulasi dan karakteristik inokulum tersebut. Lama inkubasi tidak selalu sama untuk setiap kali periode pembiakan. Untuk memperoleh hasil akhir starter yang berkualitas baik, jumlah inokulum biasanya 1 vv dari susu medium dan diinkubasi selama 14-16 jam pada suhu 22,2 °C Daulay 1991.

2.3 SKRINING BAL UNTUK PEMBUATAN KEJU

Menurut arti katanya, skriningadalah suatu tindakan atau tes yang dilakukan terhadap suatu objek untuk mengetahui karakteristik dari objek itu sehingga bisa diseleksi dan diidentifikasi untuk tujuan tertentu. Jadi, dapat diartikan bahwa skriningpada Bakteri Asam Laktat adalah suatu tindakan atau tes untuk mengetahui karakter dari BAL tersebut sehingga dapat diseleksi maupun diidentifikasi untuk keperluan tertentu. Contohnya adalahskriningpada BAL untuk seleksi starterpada keju,skriningaktivitas proteolitik, skrining aktivitas antibiotik,skriningaktivitas probiotik, skriningeksopoli-sakarida EPS, dan sebagainya Kivanc et al. 2011.

2.4 KURVA PERTUMBUHAN MIKROORGANISME

Kurva pertumbuhan mikroorganisme merupakan gambaran pertumbuhan secara bertahap yang diukur dari kuantitas N sel dalam waktu t tertentu. Pertumbuhan mikroorganisme dimulai dari awal pertumbuhan sampai dengan berakhirnya aktivitas merupakan proses bertahap yang dapat digambarkan sebagai kurva pertumbuhan. Kurva pertumbuhan biasanya terbagi dalam 5 fase pertumbuhan, tetapi lebih terinci dalam 7 fase yakni sebagai berikut: 6

1. Fasepermulaan atau fase penyesuaian yang merupakan fase pengaturan suatu aktivitas

dalam lingkungan baru. Oleh karena itu, selama fase ini pertambahan massa atau pertambahan jumlah sel belum begitu terjadi sehingga kurva fase ini umumnya mendatar.

2. Fase akselerasiatau pertumbuhan yang dipercepat merupakan fase sel bakteri mulai

membelah diri, tetapi waktu generasinya masih panjang sehingga jumlah selnya bertambah dengan kecepatan yang masih rendah. Fase permulaan dan fase akselerasi sering disebut lag phase.

3. Fase eksponensial atau logaritmik merupakan fase penambahan jumlah mencapai

kecepatan maksimum, waktu generasinya pendek dan konstan sehingga kurvanya dalam bentuk eksponensial. Selama fase ini, metabolisme terjadi paling pesat sehingga sintesis bahan sel juga terjadi sangat cepat dan konstan. Keadaan ini berlangsung terus hingga salah satu nutrien habis atau terjadi penimbunan hasil metabolit yang bersifat racun sehingga menghabat pertumbuhan. 4. Fase retardasi atau pengurangan merupakan fase dimana penambahan aktivitas sudah mulai berkurang atau menurun yang diakibatkan karena beberapa faktor, misalnya berkurangnya sumber hara, terbentuknya senyawa penghambat, dan lain sebagainya. 5. Fase stasioner merupakan fase terjadinya keseimbangan penambahan dan penurunan aktivitas atau dalam pertumbuhan koloni terjadi keseimbangan antara jumlah bakteri yang dihasilkan dan yang mati. Oleh karena itu, fase ini membentuk kurva datar. Fase ini juga diakibatkan karena sumber hara yang semakin berkurang, terbentuknya senyawa penghambat dan faktor lingkungan yang mulai tidak menguntungkan. Gambar 2. Kurva pertumbuhan mikroorganisme 6.Fase kematian merupakan fase mulai terhentinya aktivitas atau dalam pertumbuhan koloni terjadi kematian yang mulai melebihi bertambahnya individu. 7.Fase kematian logaritmik merupakan fase peningkatan kematian yang semakin meningkat mencapai maksimal dan kecepatan pembelahan menjadi nol sehingga kurva menunjukan garis menurun Hidayat et al., 2006. Waktu Fase stasioner L og j um la h sel h id u p Fase adaptasi Fase akselerasi Fase eksponensial Fase retardasi Fase kematian Fase kematian logaritmik 7 Metabolit diklasifikasikan menjadi dua, yaitu metabolit primer dan metabolit sekunder. Metabolit primer yang dibentuk dalam jumlah terbatas adalah penting untuk pertumbuhan dan kehidupan mahluk hidup. Metabolit sekunder tidak digunakan untuk pertumbuhan dan dibentuk dari metabolit primer pada kondisi stres Nofiani 2008. Untuk produksi metabolit primer, kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang diikuti dengan sintesis produk. Untuk produksi metabolit sekunder, kondisi kultivasi harus dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjang fase stasioner. Contoh dari metabolit primer seperti gliserol, asam asetat, asam laktat, aseton, butanol dan butanadiol, serta berbagai asam organik, asam amino, vitamin, polisakarida dan xanthan. Sedangkan contoh dari metabolit sekunder yang berguna kelompok metabolit yang tidak memainkan peranan langsung dalam kehidupan mikroorganisme seperti penisilin, steptomissin, oksitetrasiklin, sefalosporin, gibelerin, alkaloid dan aktinomisin Nurcahyo 2011. 8 III. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 BAHAN DAN ALAT PENELITIAN

Alat-alat yang digunakan saat skrining adalah cawan petri, tabung reaksi, tips dan kotak tips, mikropipet 5 mL dan 1 mL, bunsen, botol semprot, rak tabung reaksi, plastik tahan panas, tusuk gigi, ose sekali pakai, otoklaf, laminar, label, pipet pasteur, bumbung pipet, inkubator, spektrofotometer HITACHI U-3900H,shaker ROSI 1000, plastik seal wrap, timbangan analitik, kertas timbang, sudip, vorteks, erlenmeyer 1000 mL, 500 mL, 300 mL dan 250 mL, kapas, gelas ukur 500 mL dan 100 mL, tisu, isolasi, karet gelang, spidol marker, micro tube dan raknya. Bahan- bahan yang dibutuhkan saat skriningadalah MRS, agar, CaCO 3 , gliserol, alkohol 70, aquades, 39 isolat remaja BAL LIPI-Cibinong, spirtus, susu skim, aquades, dan susu sapi pasteurisasi. Alat-alat yang digunakan saat produksi keju adalah pengaduk, water bath, botol selai, kain kasa, gelas ukur, kertas pH indikator, tabung reaksi, kapas. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan keju adalah susu sapi pasteurisasi, isolat BAL berpotensi tinggiLIPI-Cibinong, dan rennet Rhyzomucor miehikomersialCuajo Holandes, Fromase ® 50 DSM Food Specialities.

3.2 METODE PENELITIAN

Penelitian ini terdiri ataslima tahap penelitian lihat Gambar 3 yaitu skrining potensi asam, skrining potensi protease, skrining potensi koagulasi, pembuatan kurva pertumbuhan dan pengujian dalam pembuatan keju.

3.2.1 SkriningPotensi Asam

BAL yang memiliki potensi dalam menghasilkan asam secara kualitatif, diseleksi dengancara skrining menggunakan medium MRSA + CaCO 3 0.5 Khunajakr et al. 2008. Komposisi MRS dapat dilihat pada Tabel 2. Inkubasi dilakukan selama 68 jam pada suhu mesofilik 26 °C.BAL yang memiliki potensi asam akan menghasilkan zona bening selama waktu inkubasi..Fardiaz 1989 menyatakan bahwa mikroorganisme mesofilik merupakan kelompok mikroorganisme yang hidup pada kisaran suhu 10 °C sampai 45 °C dengan kisaran suhu optimum pertumbuhan 20 °C sampai 40 °C dan minimum 10 °C sampai 20 °C. Seleksi potensi asam BAL secara kuantitatif dilakukan dengan cara menghitung perbandingan diameter zona bening dan koloni menggunakan rumus indeks zona bening. Tahapan skrining potensi asam dapat dilihat pada Gambar 4. Indeks zona bening asam = 9 Gambar 3. Tahapan penelitian Tabel 2. Komposisi MRS agar per liter No. Komposisi Jumlah 1. Glukosa 20 gram 2. Pepton 10 gram 3. Agar 10 gram 4. Ekstrak daging 8 gram 5. Natrium asetat.3H 2 O 5 gram 6. Ekstrak ragi 4 gram 7. K 2 HPO 4 2 gram 8. Triamonium sitrat 2 gram 9. MgSO 4 .7H 2 O 0,2 gram 10. Sorbiton monooleat 0,05 gram 11. MnSO 4 .4H 2 O 1,0 ml Sumber: Atlas 1993 dalam Kusuma 2009

3.2.2 SkriningPotensi Protease

BAL yang berpotensi memiliki aktivitas protease secara kualitatifdiseleksi dengan cara skrining menggunakan medium SMA skim milk agarTaheri et al. 2009. Inkubasi dilakukan selama 68 jam pada suhu ruang 26 °C.BAL yang berpotensi memiliki aktivitas protease akan menghasilkan zona bening selama waktu inkubasi. Seleksi BAL secara kuantitatif dilakukan dengan caramenghitung perbandingan diameter zona bening dan koloni menggunakan rumus indeks zona bening Akhdia 2003. Tahapan skrining potensi protease dapat dilihat pada Gambar 5. Isolat BAL remaja Skrining potensi asam Skrining potensi protease Skrining potensi koagulasi Isolat berpotensi tinggi Pembuatan kurva pertumbuhan Pengujian dalam pembuatan keju Starter keju terpilih I II 10 Indeks zona bening protease =

3.2.3 SkriningPotensi Koagulasi

BAL yang memiliki potensi koagulasidiseleksi dengan cara skrining menggunakan medium susu sapi pasteurisasi. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruang 26 °C.BAL yang berpotensi mengoagulasi susu akan menghasilkan curd selama waktu inkubasi lihat Gambar 6. Metode ini merupakan prinsip sederhana dari proses pembuatan keju sekaligus penentu atas terpilihnya beberapa isolat yang akan diujikan dalam pembuatan keju. Gambar 4. Tahapan skrining potensi asam Gambar 5. Tahapan skrining potensi protease Isolat BAL remaja Ditumbuhkan T = 26 °C, t = 68 jam MRSA+CaCO 3 0.5 Diukur diameter zona bening asam dan koloni BAL Dihitung Rumus indeks zona bening asam Indeks zona bening asam Isolat BAL remaja Ditumbuhkan T = 26 °C, t = 68 jam SMA Diukur diameter zona bening protease dan koloni BAL Dihitung Rumus indeks zona bening protease Indeks zona bening protease 11

3.2.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan

Hasil dariskriningmerupakanisolat berpotensi untuk diujikan pembuatan keju. Sebelumnya, untuk mengetahui waktu optimum pertumbuhan isolat terpilih tersebut, dilakukan pembuatan prekultur 10 dari kultur yang nantinya akan dilakukan sampling untuk pembuatan kurva pertumbuhan. Waktu optimum pertumbuhan, juga dapat mengetahui waktu optimum produksi asam atau enzim sebab asam atau enzim termasuk dalam metabolit primer yang dapat dipanen dengan memperpanjang fase logaritmik Nurcahyo 2011.Bila fase logaritmik mencapai optimum, maka produksi metabolit primer juga optimum. Tujuan pembuatan prekultur adalah untuk masa adaptasi isolat sebelum memasuki medium yang lebih besar kultur. Prekultur diinkubasi dengan medium MRSB pada suhu ruang 27 °C dan dihomogenisasidengan kecepatan 150 rpm. Setelah 24 jam,1.75 mL prekultur dipindahkan ke kultur dengan perlakuan yang sama. Lalu dilakukan samplingtiap sampel sebanyak 1 mL secara aseptis dalam waktusehari 3-4 kali dengan jeda waktu tiap dua jam sekali. Hasil sampling lalu diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 660 nm Widyastuti et al., 1997. Kegiatan dari awal pembuatan prekultur hingga pengukuran absorbansi dilakukan sebanyak dua kali ulangan.Tahapan pembuatan kurva pertumbuhan dapat dilihat pada Gambar 7.

3.2.5 Pengujian dalam Pembuatan Keju

Setelah mengetahui waktu optimum pertumbuhan isolat potensial, maka dilakukan pengujian dalam pembuatan keju segar skala laboratorium. Proses pembuatan keju diawali dengan pembuatan starter induk yaitu satu ose isolat potensial diinokulasikan dalam susu steril dengan variasi konsentrasi 0 kontrol, 2, 4, 6, 8, dan 10. Selanjutnya, starter induk diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Setelah itu, starter induk dicampurkan pada susu pasteurisasi suhu 37 °C dan didiamkan selama 15 menit. Selanjutnya, ditambahkan rennet komersial dengan variasi konsentrasi 0.005 dan 0.01 sehingga akan terbentuk koagulum. Hasil curd yang terbentuk dipotong berbentuk kubus dengan ukuran 1.5-2 cm dan disaring dengan kain kasa. Kegiatan dari awal pembuatan starter induk hingga penghitungan rendemen dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Gambaran tahapan dapat dilihat pada Gambar 8. Gambar 6. Tahapan skrining potensi koagulasi Isolat BAL remaja Ditumbuhkan T = 26 °C, t = 24 jam Susu pasteurisasi 3 mL Koagulum 12 Parameter yang diujikan dalam pembuatan keju adalah pengukuran pH, pengujian aktivitas rennet, penghitungan rendemen keju yang dihasilkan dan penilaian sensori.

3.2.5.1 Pengukuran pH

Pengukuran pH dilakukan tiga kali, yaitu 1 pada susu bahan baku yang akan diolah menjadi keju; 2 pada starter yang telah diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 °C; dan 3 pada susu bahan baku yang telah dicampur seketika dengan starter. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan kertas pH indikator.

3.2.5.2 Pengujian Aktivitas Rennet

Pengujian kemampuan rennet dalam mengoagulasi susu dilakukan dengan menggunakan metode Scott 1981. Penggunaan konsentrasi rennet disesuaikan dengan resep komersialnya yaitu 0.01 dan dilakukan tambahan perlakuan dengan konsentrasi 0.005 lihat Lampiran 3. Sebanyak100 ml susu dengan suhu 37 °C ditambahkan starter dengan beberapa perlakuan sehingga terjadi variasi penurunan pH awal susu. Setelah penambahan starter,dilakukan penambahan rennet. Campuran tersebut kemudian diaduk beberapa saat hingga homogendan didiamkan sambil diamati sampai terjadi koagulasi susu. Terjadinya koagulasi ditandai dengan meningkatnya viskositas susu membentuk curd sehingga terasa berat dalam pengadukan. Isolat remaja terpilih MRSB 1.75 mL Diinkubasi T = 27 °C, t = 24 jam, 150 rpm Prekultur Diinkubasi T = 27 °C, 150 rpm MRSB 17.5 mL di-sampling Diukur absorbansinya λ = 660 nm Kurva pertumbuhan Gambar 7. Tahapan pembuatan kurva pertumbuhan 13 Susu sapi pasteurisasi 100 mL Dipanaskan T = 37 °C Diinkubasi T = 37 °C, t = 15 menit Isolat berpotensi tinggi 0 kontrol, 2, 4, 6, 8, 10 Koagulum Rennet komersial 0.005, 0.01 Whey Curd dipotong kubus 1.5-2 cm Disaring dengan kain kasa Keju Segar Susu + isolat 2 Susu + isolat 6 Susu + isolat 4 Susu + isolat 8 Susu + isolat 10 Susu kontrol Susu kontrol + rennet 0.005 Susu kontrol + rennet 0.01 Susu + isolat 2 + rennet 0.005 Susu + isolat 2 + rennet 0.01 Susu + isolat 4 + rennet 0.005 Susu + isolat 4 + rennet 0.01 Susu + isolat 6 + rennet 0.005 Susu + isolat 6 + rennet 0.01 Susu + isolat 8 + rennet 0.005 Susu + isolat 8 + rennet 0.01 Susu + isolat 10 + rennet 0.005 Susu + isolat 10 + rennet 0.01 Gambar 8. Tahapan pembuatan keju segar 14

3.2.5.3 Penghitungan Rendemen

Beberapa sampel keju yang telah dihasilkan, dihitung rendemennya untuk mengetahui adanya pengaruh variasi konsentrasi isolat berpotensi tinggidan rennet komersial yang digunakan terhadap berat keju yang dihasilkan. Penghitungan ini menggunakan metode gravimetri seperti pada persamaan. Rendemen keju = 3.2.5.4Penilaian Sensori Terakhir, beberapa sampel keju yang dihasilkan juga dinilai sensorinya untuk mengetahui rasa, tekstur dan aroma keju secara deskriptif. Penilaian ini masih bersifat sederhana sebab produksi keju yang dilakukan masih berskala laboratorium. IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 SELEKSI ISOLAT BERPOTENSI TINGGI