Desain Penelitian Pengolahan dan Analisa Data Alur Penelitian

25

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Desain yang digunakan pada penelitian ini adalah desain eksperimental.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

3.2.1 Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari – Juni 2014

3.2.2 Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Animal House, laboratorium Biologi dan laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, jl. Kertamukti No. 05, Pisangan, Ciputat 15419, Tangerang Selatan.

3.3 Populasi dan Sampel Penelitian

Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan strain Sprague dawley berumur 90 hari, dengan berat badan rata-rata 180-200 gram. Sampel diperoleh dari Departemen Patologi Institut Pertanian Bogor IPB. Lampiran 1 Terdapat tiga kelompok pada penelitian ini, kelompok I adalah kontrol negatif atau kelompok tanpa perlakuan Kelompok II adalah kontrol positif atau kelompok tikus DM yang diinduksi dengan Streptozotocin 48- 60 mgkgbb. Kelompok III adalah tikus DM yang telah diinduksi dengan streptozotocin dan diberikan terapi ekstrak Habbatusauda dengan dosis 300 mgkgbbhari. Untuk menentukan jumlah sampel pada setiap kelompok penelitian, digunakan rumus Federer sebagai berikut : n-1 t-1 ≥15, dengan t = jumlah kelompok, n = jumlah sampel  n-1 3-1 ≥15  n-12 ≥15  n-1 ≥152  n ≥152 + 22  n ≥8,5 bulatkan 9 Berdasarkan perhitungan tersebut, maka jumlah sampel minimal yang diperlukan adalah 9 tikus pada setiap kelompok. Untuk menghindari adanya kejadian yang tidak terduga, maka akan ditambahkan menjadi 10 tikus hingga total menjadi 30 tikus.

3.3.1 Kriteria Inklusi

1. Kelompok kontrol negatif : Tikus jantan strain Sprague dawley dengan glukosa darah sewaktu 200 mgdL . 2. Kelompok kontrol positif dan perlakuan: Tikus jantan strain Sprague dawley dengan glukosa darah sewaktu 200 mgdL

3.3.2 Kriteria Eksklusi

1. Tikus betina, tikus dinyatakan sakit dan cacat 3.4. Cara Kerja Penelitian 3.4.1 Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah glukometer beserta strip dan lansetnya, kit trigliserida, vorteks, centrifuge, spektrofotometer, minor set, tabung EDTA dan tabung mikro, timbangan untuk mengukur berat badan tikus, sonde, kandang tikus, botol minuman dan tempat makanan tikus.

3.4.2 Bahan Penelitian

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian adalah ekstak dari biji Habbatusauda Nigella sativa yang diperoleh dari pusat konservasi Kebun Raya Bogor sebanyak 2 kg . Bahan-bahan kimia yang digunakan pada proses induksi adalah: Streptozotocin, dapar sitrat dan aquades. Untuk proses sacrifice menggunakan dietileter ether. Sedangkan untuk proses pengukuran kadar kolesterol digunakan reagen kit kolesterol.

3.4.3 Adaptasi Hewan Coba

Hewan coba diadaptasikan di Animal house selama 14 hari. Hewan coba diadaptasikan baik terhadap tempat tinggal baru maupun adaptasi terhadap makanan dan minuman dengan tetap memastikan higienitas kandang dan makanan

3.4.4 Induksi Tikus Dengan Streptozotocin

Hari ke-15 tikus dipuasakan selama 10 jam sebelum diinduksi dengan streptozotocin 48-60 mgkgbb secara intraperitoneal. Injeksi STZ mengarah pada degenerasi dari sel beta pankreas pada pulau langerhans. 22 Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan 5 hari setelah induksi hari ke-21. Tikus dengan glukosa darah lebih dari 200 mgdl digunakan untuk kelompok kontrol positif dan kelompok perlakuan.

3.4.5 Pemberian Ekstrak Habbatusauda Terhadap Tikus

Setelah tikus dinyatakan DM, dilakukan pemberian ekstrak Habbatusauda setiap hari selama 3 minggu hari ke-21-41, ekstrak habbatussauda diberikan secara oral menggunakan alat sonde dengan dosis 300 mgkgbbhari.

3.4.6 . Pengukuran Sampel

3.4.6.1 Glukosa Darah

Pengambilan darah dilakukan dua kali, yaitu pertama saat sebelum pemberian ekstrak dan terakhir saat pemberian ekstrak selesai hari ke 42. Pengambilan darah dilakukan dengan memotong sedikit ujung ekor tikus. Sebelum pemotongan ekor terlebih dahulu tikus dibius sampai tidak sadarkan diri menggunakan larutan eter yang memiliki efek anastesi secara inhalasi, proses ini bertujuan untuk mengurangi rasa sakit saat dipotong ujung ekornya. Darah diteteskan pada strip pengukur glukosa darah dan diukur dengan glukometer. Pengukuran yang dilakukan adalah untuk mengukur kadar glukosa darah tikus.

3.4.6.2 Kolesterol Darah

Setelah mendapatkan data glukosa darah tikus selama 3 minggu pemberian ekstrak jintan hitam, maka tikus akan di sacrifice hari ke-42 dengan cara dibius terlebih dahulu menggunakan larutan eter sampai mati. Setelah mati tikus dibedah dan akan dilakukan pengambilan darah tikus sebanyak 3 cc melalui vena cava inferior. Kemudian darah yang diambil dimasukan dalam tabung mikro 1,5 ml untuk selanjutnya dilakukan sentrifugasi. Sentrifugasi dilakukan selama 15 menit, dengan kecepatan 3000 rpm. Plasma yang diperoleh kemudian dipisahkan dan disimpan kembali ke tabung mikro dan disimpan dalam kulkas pada suhu - 80˚C, untuk pengukuran kolesterol selanjutnya. Pengukuran kadar kolesterol plasma sampel menggunakan kit kolesterol dan dibaca dengan menggunakan ELISA reader.

3.5 Pengolahan dan Analisa Data

Data glukosa darah dan kolesterol yang terkumpul dilakukan pengolahan dan pengujian data secara komputerisasi menggunakan STATA versi 11.0. Uji statistik yang digunakan adalah One-Way Anova karena variabel yang diteliti adalah kategorik-numerik lebih dari 2 kelompok dengan data tidak berpasangan.

3.6 Alur Penelitian

Tikus Tiba di Animal House hari 1 Adaptasi selama 2 minggu Makan, minum dan serbuk kandang ad libitum hari 1-14 Kontrol - n=9 ,Gula darah 200 mgdl hari 15 Tikus yang akan diinduksi N= 18 tikus Gula darah 200 mgdl Induksi STZ 60 mgkgbb Hari 15 Kontrol + n=9 Gula darah pada hari ke 21 200 mgdl Makan, minum dan serbuk kandang ad libitum Hari 21 Perlakuan, n=9 Gula darah pada hari ke 21 200 mgdl Makan, minum dan serbuk kandang ad libitum Hari 21 Sonde oral aquades 3 ml Makan, minum dan serbuk kandang ad libitum hari 21-41 Sonde oral aquades 3 ml Makan, minum dan serbuk kandang ad libitum hari 21-41 Sonde oral Ekstrak Nigella sativa 300 mgkgbbhari dalam aquades 3 ml Makan, minum dan serbuk kandang ad libitum hari 21-41 Sacrifice Ukur Gula darah , Sacrifice, ether dan pengambilan darah dari vena cava inferior sebanyak 3 cc Hari 42 Sentrifugasi darah 3000 rpm Hasil plasma disimpan di refrigerator -80°c Plasma dicampur dengan kit kolesterol Analisis kolesterol Kadar gula darah Kadar kolesterol darah Analisis statistik 30

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Jumlah hewan dalam penelitian ini adalah 27 ekor tikus yang merupakan jumlah minimal hewan coba sesuai dengan rumus Federer. Setelah diberikan perlakuan ekstrak Nigella sativa selama 3 minggu, jumlah hewan dalam penelitian yang tersisa 18 ekor tikus. 9 ekor tikus mati setelah proses induksi STZ dan selama penelitian berlangsung. 18 hewan penelitian yang tersisa masing-masing adalah: 6 hewan untuk kontrol negatif, 6 hewan untuk kontrol positif dan 6 hewan untuk kelompok perlakuan. Kematian hewan penelitian diduga antara lain akibat efek toksisitas pada STZ, banyaknya orang yang sering keluar masuk Animal house. Hal ini dapat menyebabkan hewan coba rentan terkena infeksi dan stres. Proses pengelompokan kelompok kontrol positif dan kelompok perlakuan tidak secara random sampling, tetapi berdasarkan tingginya kadar gula darah setelah diinduksi STZ, dengan tujuan dapat terlihatnya pengaruh pemberian ekstrak secara nyata.

4.1. Glukosa Darah

Data glukosa darah yang diambil adalah jumlah rerata dari glukosa darah pada saat sebelum diinduksi STZ, 1 minggu setelah diinduksi STZ dan akhir penelitian pemberian Nigella sativa selama 3 minggu masing-masing kelompok. Data yang didapatkan selama penelitian adalah : Tabel 4.1 Rerata Glukosa Darah Tikus Setiap Kelompok Penelitian Kelompok Sebelum Diinduksi mgdL 1 minggu Setelah Diinduksi mgdl Setelah Minggu ke-3 Perlakuan mgdl persentase Kontrol - 106.7 ± 27.29 122.2 ± 13.92 133.3 ± 23.62 9 ↑↑ Kontrol + 150.8 ± 33.97 469.0 ± 87.43 516.7 ± 64.18 10,2 ↑↑ Perlakuan 141.8 ± 20.48 487.9 ± 86.16 348.5 ± 36.29 28.6 ↓↓ Data adalah mean ± Std.Deviasi