25
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Desain yang digunakan pada penelitian ini adalah desain eksperimental.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
3.2.1 Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari – Juni 2014
3.2.2 Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Animal House, laboratorium Biologi dan laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, jl.
Kertamukti No. 05, Pisangan, Ciputat 15419, Tangerang Selatan.
3.3 Populasi dan Sampel Penelitian
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan strain Sprague dawley berumur 90 hari, dengan berat badan rata-rata 180-200
gram. Sampel diperoleh dari Departemen Patologi Institut Pertanian Bogor IPB. Lampiran 1
Terdapat tiga kelompok pada penelitian ini, kelompok I adalah kontrol negatif atau kelompok tanpa perlakuan Kelompok II adalah kontrol
positif atau kelompok tikus DM yang diinduksi dengan Streptozotocin 48- 60 mgkgbb. Kelompok III adalah tikus DM yang telah diinduksi dengan
streptozotocin dan diberikan terapi ekstrak Habbatusauda dengan dosis 300 mgkgbbhari.
Untuk menentukan jumlah sampel pada setiap kelompok penelitian, digunakan rumus Federer sebagai berikut :
n-1 t-1 ≥15, dengan t = jumlah kelompok, n = jumlah sampel
n-1 3-1 ≥15
n-12 ≥15
n-1 ≥152
n ≥152 + 22
n ≥8,5 bulatkan 9
Berdasarkan perhitungan tersebut, maka jumlah sampel minimal yang diperlukan adalah 9 tikus pada setiap kelompok. Untuk menghindari
adanya kejadian yang tidak terduga, maka akan ditambahkan menjadi 10 tikus hingga total menjadi 30 tikus.
3.3.1 Kriteria Inklusi
1. Kelompok kontrol negatif : Tikus jantan strain Sprague dawley dengan glukosa darah sewaktu 200 mgdL .
2. Kelompok kontrol positif dan perlakuan: Tikus jantan strain Sprague dawley dengan glukosa darah sewaktu 200 mgdL
3.3.2 Kriteria Eksklusi
1. Tikus betina, tikus dinyatakan sakit dan cacat
3.4. Cara Kerja Penelitian 3.4.1 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah glukometer beserta strip dan lansetnya, kit trigliserida, vorteks, centrifuge,
spektrofotometer, minor set, tabung EDTA dan tabung mikro, timbangan untuk mengukur berat badan tikus, sonde, kandang tikus, botol minuman
dan tempat makanan tikus.
3.4.2 Bahan Penelitian
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian adalah ekstak dari biji Habbatusauda Nigella sativa yang diperoleh dari pusat konservasi
Kebun Raya Bogor sebanyak 2 kg . Bahan-bahan kimia yang digunakan pada proses induksi adalah:
Streptozotocin, dapar sitrat dan aquades. Untuk proses sacrifice menggunakan dietileter ether. Sedangkan untuk proses pengukuran kadar
kolesterol digunakan reagen kit kolesterol.
3.4.3 Adaptasi Hewan Coba
Hewan coba diadaptasikan di Animal house selama 14 hari. Hewan coba diadaptasikan baik terhadap tempat tinggal baru maupun adaptasi
terhadap makanan dan minuman dengan tetap memastikan higienitas kandang dan makanan
3.4.4 Induksi Tikus Dengan Streptozotocin
Hari ke-15 tikus dipuasakan selama 10 jam sebelum diinduksi dengan streptozotocin 48-60 mgkgbb secara intraperitoneal. Injeksi STZ mengarah
pada degenerasi dari sel beta pankreas pada pulau langerhans.
22
Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan 5 hari setelah induksi hari ke-21. Tikus
dengan glukosa darah lebih dari 200 mgdl digunakan untuk kelompok kontrol positif dan kelompok perlakuan.
3.4.5 Pemberian Ekstrak Habbatusauda Terhadap Tikus
Setelah tikus dinyatakan DM, dilakukan pemberian ekstrak Habbatusauda setiap hari selama 3 minggu hari ke-21-41, ekstrak
habbatussauda diberikan secara oral menggunakan alat sonde dengan dosis 300 mgkgbbhari.
3.4.6 . Pengukuran Sampel
3.4.6.1 Glukosa Darah
Pengambilan darah dilakukan dua kali, yaitu pertama saat sebelum pemberian ekstrak dan terakhir saat pemberian ekstrak selesai hari ke 42.
Pengambilan darah dilakukan dengan memotong sedikit ujung ekor tikus. Sebelum pemotongan ekor terlebih dahulu tikus dibius sampai tidak sadarkan
diri menggunakan larutan eter yang memiliki efek anastesi secara inhalasi, proses ini bertujuan untuk mengurangi rasa sakit saat dipotong ujung
ekornya. Darah diteteskan pada strip pengukur glukosa darah dan diukur dengan glukometer. Pengukuran yang dilakukan adalah untuk mengukur
kadar glukosa darah tikus.
3.4.6.2 Kolesterol Darah
Setelah mendapatkan data glukosa darah tikus selama 3 minggu pemberian ekstrak jintan hitam, maka tikus akan di sacrifice hari ke-42
dengan cara dibius terlebih dahulu menggunakan larutan eter sampai mati. Setelah mati tikus dibedah dan akan dilakukan pengambilan darah tikus
sebanyak 3 cc melalui vena cava inferior. Kemudian darah yang diambil dimasukan dalam tabung mikro 1,5 ml untuk selanjutnya dilakukan
sentrifugasi. Sentrifugasi dilakukan selama 15 menit, dengan kecepatan 3000 rpm. Plasma yang diperoleh kemudian dipisahkan dan disimpan kembali ke
tabung mikro dan disimpan dalam kulkas pada suhu - 80˚C, untuk pengukuran
kolesterol selanjutnya. Pengukuran kadar kolesterol plasma sampel menggunakan kit kolesterol dan dibaca dengan menggunakan ELISA reader.
3.5 Pengolahan dan Analisa Data
Data glukosa darah dan kolesterol yang terkumpul dilakukan pengolahan dan pengujian data secara komputerisasi menggunakan STATA versi 11.0.
Uji statistik yang digunakan adalah One-Way Anova karena variabel yang diteliti adalah kategorik-numerik lebih dari 2 kelompok dengan data tidak
berpasangan.
3.6 Alur Penelitian
Tikus Tiba di Animal House
hari 1
Adaptasi selama 2 minggu Makan, minum dan serbuk
kandang ad libitum
hari 1-14
Kontrol - n=9
,Gula darah 200 mgdl
hari 15
Tikus yang akan diinduksi N= 18 tikus
Gula darah 200 mgdl Induksi STZ 60 mgkgbb
Hari 15
Kontrol + n=9
Gula darah pada hari ke 21 200 mgdl
Makan, minum dan serbuk kandang ad libitum
Hari 21 Perlakuan, n=9
Gula darah pada hari ke 21 200 mgdl
Makan, minum dan serbuk kandang ad libitum
Hari 21
Sonde oral aquades 3 ml Makan, minum dan serbuk
kandang ad libitum
hari 21-41
Sonde oral aquades 3 ml Makan, minum dan serbuk
kandang ad libitum
hari 21-41
Sonde oral Ekstrak Nigella sativa 300 mgkgbbhari
dalam aquades 3 ml Makan, minum dan serbuk
kandang ad libitum
hari 21-41
Sacrifice
Ukur Gula darah , Sacrifice, ether dan pengambilan
darah dari vena cava inferior sebanyak 3 cc
Hari 42
Sentrifugasi darah 3000 rpm Hasil plasma disimpan di
refrigerator -80°c
Plasma dicampur dengan kit kolesterol
Analisis kolesterol
Kadar gula darah
Kadar kolesterol
darah Analisis
statistik
30
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah hewan dalam penelitian ini adalah 27 ekor tikus yang merupakan jumlah minimal hewan coba sesuai dengan rumus Federer. Setelah diberikan
perlakuan ekstrak Nigella sativa selama 3 minggu, jumlah hewan dalam penelitian yang tersisa 18 ekor tikus. 9 ekor tikus mati setelah proses induksi STZ dan
selama penelitian berlangsung. 18 hewan penelitian yang tersisa masing-masing adalah: 6 hewan untuk kontrol negatif, 6 hewan untuk kontrol positif dan 6 hewan
untuk kelompok perlakuan. Kematian hewan penelitian diduga antara lain akibat efek toksisitas pada STZ, banyaknya orang yang sering keluar masuk Animal
house. Hal ini dapat menyebabkan hewan coba rentan terkena infeksi dan stres. Proses pengelompokan kelompok kontrol positif dan kelompok perlakuan
tidak secara random sampling, tetapi berdasarkan tingginya kadar gula darah setelah diinduksi STZ, dengan tujuan dapat terlihatnya pengaruh pemberian
ekstrak secara nyata.
4.1. Glukosa Darah
Data glukosa darah yang diambil adalah jumlah rerata dari glukosa darah pada saat sebelum diinduksi STZ, 1 minggu setelah diinduksi STZ dan akhir
penelitian pemberian Nigella sativa selama 3 minggu masing-masing kelompok. Data yang didapatkan selama penelitian adalah :
Tabel 4.1 Rerata Glukosa Darah Tikus Setiap Kelompok Penelitian
Kelompok Sebelum
Diinduksi mgdL
1 minggu Setelah Diinduksi
mgdl Setelah Minggu ke-3
Perlakuan mgdl
persentase
Kontrol - 106.7 ± 27.29
122.2 ± 13.92 133.3 ± 23.62
9 ↑↑
Kontrol + 150.8 ± 33.97
469.0 ± 87.43 516.7 ± 64.18
10,2 ↑↑
Perlakuan 141.8 ± 20.48
487.9 ± 86.16 348.5 ± 36.29
28.6 ↓↓
Data adalah mean ± Std.Deviasi