16
BAB III METODELOGI PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan terhadap rimpang kencur berdasarkan metode eksperimental dengan tahapan penelitian yaitu pengumpulan tumbuhan,
pengolahan simplisia, pembuatan pereaksi, pemeriksaan karakteristik simplisia, Pemeriksaan skrining fitokimia simplisia, pembuatan ekstrak, penyiapan hewan
percobaan, perlakuan pemberian obat terhadap hewan percobaan, pengambilan urin, urin yang diperoleh divorteks dan disentrifuge dan di ambil supernatan
kemudian diukur dengan spektrofotometer ultraviolet.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas laboratorium, blender National, lemari pengering, perkolator, oven, cawan penguap, Rotary evaporator
Heidolph VV-300, oral sonde, timbangan hewan GW-1500, neraca analitik Mettler Toledo, tabung sentrifuge, rak tabung, alat vortex, alat
sentrifugeVelocity 18R, spuit, labu tentukur, pipet tetes, spektrofotometer UV shimadzu UV 1800, stamfer, mortir dan stopwatch.
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah natrium diklofenak bahan baku obat, PT. Dexa Medica, ekstrak kencur, etanol 96,
TCA Trichloro acetid acid 20 , toluen, natrium hidroksida 1 N, aquadest dan aquabidestilata.
Universitas Sumatera Utara
17
3.3 Penyiapan Sampel 3.3.1 Pengambilan Tumbuhan
Pengambilan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rimpang kencur yang masih segar yang diperoleh dari pasar pagi Tanjung Sari,
Medan, Provinsi Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di “Laboratorium Herbarium” Laboratorium Penelitian Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara,
Medan.
3.3.3 Pengolahan Sampel
Rimpang kencur yang masih segar dibersihkan dari kotoran atau bahan asing lainnya kemudian dicuci dengan air bersih lalu ditiriskan dan ditimbang
sebagai berat basah. Lalu dirajang kecil-kecil dan dikeringkan pada temperatur ruangan hingga kering ditandai dengan rimpang mudah dipatahkan dan ditimbang
sebagai berat kering. Irisan rimpang kencur kering diblender hingga menjadi serbuk dan ditimbang sebagai berat serbuk simplisia. Lalu disimpan dalam wadah
plastik, diberi etiket dan disimpan ditempat kering.
3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan
kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
18
3.4.1 Pemeriksaan Makroskopik dan Organoleptik
Pemeriksaan makroskopik dan organolepik dilakukan dengan mengamati bentuk, bau dan rasa dari rimpang kencur segar dan serbuk simplisia rimpang
kencur.
3.4.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia rimpang kencur. Serbuk simplisia rimpang kencur diletakkan di atas kaca objek yang telah
ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
3.4.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluena. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung,
tabung penerima 10 ml, alat penampung dan pemanas listrik. Cara kerja:
Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan mendingin selama 30
menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah
ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian
besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan
toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah
Universitas Sumatera Utara
19 sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air
yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992; Ditjen POM, 1995.
3.4.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai
kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1992;
Ditjen POM, 1995.
3.4.5 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1992; Ditjen
POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
20
3.4.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang
habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang
sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1992;
Ditjen POM, 1995. 3.4.7 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu
yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
WHO, 1992; Ditjen POM, 1995. 3.5 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, glikosida dan steroidtriterpenoid.
3.5.1 Pemeriksaan Flavanoid
Sebanyak 10 g simplisia ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1
g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika warna merah atau kuning atau
jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
Universitas Sumatera Utara
21
3.5.2 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada
masing-masing tabung reaksi a.
Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b.
Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c.
Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan
diatas Ditjen POM, 1995.
3.5.3 Pemeriksaan Saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1 - 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan buih tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam
klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1995.
3.5.4 Pemeriksaan Tanin
Simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 30 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1 – 2 tetes
pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tannin Farnsworth, 1966.
Universitas Sumatera Utara
22
3.5.5 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96-air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2
jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit, lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran kloroform-isopropanol 3:2 sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari lapisan isopropanol diuapkan pada suhu
tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dengan 2 ml metanol untuk larutan percobaan. 0,1 ml larutan percobaan diuapkan di atas penangas air, pada sisa
ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes Molish, kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat, terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan, menunjukkan
adanya ikatan gula Ditjen POM, 1995.
3.5.6 Pemeriksaan SteroidTriterpenoid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml nheksan selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada
sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard melalui dinding cawan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau
biru hijau menunjukkan adanya triterpenoidsteroid Harborne, 1987.
Universitas Sumatera Utara
23
3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Rimpang Kencur EERK
Pembuatan ekstrak etanol rimpang kencur dilakukan dengan metode perkolasi. Caranya 350 gram serbuk simplisia direndam dengan etanol 96
selama 3 jam. Selanjutnya dipindahkan. Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, tambahkan etanol 96 secukupnya hingga simplisia
terendam dan terdapat cairan penyari di atasnya, perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Kemudian kran perkolator dibuka
dan dibiarkan cairan ekstrak menetes dengan kecepatan 20 tetes per menit dan ditambahkan etanol 96 berulang-ulang secukupnya dan diatur kecepatan
penetesan cairan penyari sama dengan kecepatan tetesan perkolat, sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan perkolat
yang keluar terakhir diuapkan dan tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Kemudian dikeringkan
dengan freeze dryer selama lebih kurang 24 jam Depkes RI, 1974.
3.7. Pembuatan Diklofenak Baku 3.7.1 Pembuatan Larutan Induk Baku I Natrium Diklofenak
Timbang seksama sejumlah 50 mg natrium diklofenak baku, dimasukan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan NaOH 0,1 N hingga garis tanda.
Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcgml.
Universitas Sumatera Utara
24
3.7.2 Pembuatan Larutan Induk Baku II Natrium Diklofenak Pipet dari LIB I sebanyak 10 ml, dimasukan ke dalam labu tentukur 50 ml,
dicukupkan dengan NaOH 0,1 N hingga garis tanda. Dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 mcgml.
3.7.3 Pengukuran panjang gelombang absorpsi maksimum didalam larutan NaOH 0,1 N
Larutan natrium diklofenak dibuat dengan konsentrasi 13 mcgmL dengan memipet 6,5 ml dari LIB II dimasukan ke dalam labu tentukur 50 ml, lalu di
tambahkan larutan NaOH 0,1 N. Serapan larutan tersebut diukur pada panjang gelombang 200 - 400 nm dengan alat spektrofotometer ultraviolet.
3.7.4 Pembuatan Kurva Baku Natrium diklofenak pada panjang gelombang maksimum
Pembuatan kurva baku natrium diklofenak pada panjang gelombang maksimum dilakukan dengan cara:
Dipipet larutan dari LIB II berturut-turut 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml; 1,2 ml; 1,4 ml; 1,6 ml dan1,8 ml larutan kemudian dimasukan ke dalam labu takar 10 ml dan di
adkan hingga 10 ml dengan larutan NaOH 0,1 N. Diperoleh larutan dengan konsentrasi 4; 6; 8; 12; 14; 16 dan 18 mcgml. Larutan diukur serapannya pada
panjang gelombang yang sesuai dengan hasil pengukuran panjang gelombang maksimum.
Universitas Sumatera Utara
25
3.8 Pembuatan Suspensi dan larutan 3.8.1 Pembuatan Suspensi CMC 1
Sebanyak 1 gram CMC yang telah ditimbang seksama ditaburkan dalam lumpang yang berisi 20 ml akuades panas. Didiamkan selama 15 menit hingga
diperoleh massa yang transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan aquadest dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, kemudian
dicukupkan volumenya dengan akuadest hingga 100 ml.
3.8.2 Pembuatan Suspensi Natrium diklofenak 0,05
Sebanyak 50 mg natrium diklofenak baku, digerus di dalam lumpang. Kemudian ditambahkan CMC 1 digerus sampai homogen. Dituang kedalam
labu tentukur 100 ml, ditambah CMC 1 sampai batas tanda, kocok hingga
homogen. 3.8.3 Penyiapan suspensi ekstrak etanol rimpang kencur 1
Sebanyak 250 mg ekstrak etanol rimpang kencur, dimasukkan ke dalam lumpang, digerus. Ditambahkan sedikit suspensi CMC 1 kemudian
dihomogenkan. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah CMC 1 sampai batas tanda.
Universitas Sumatera Utara
26
3.9 Perlakuan Terhadap Hewan Percobaan 3.9.1 Perlakuan Pada Hewan Percobaan dengan Pemberian Natrium
Diklofenak tanpa Ekstrak Etanol Rimpang Kencur EERK.
Perlakuan Pada Hewan Percobaan dengan Pemberian Natrium Diklofenak tanpa EERK adalah sebagai berikut:
1. Hewan percobaan tikus diadaptasikan selama 2 minggu. 2. Kemudian hewan percobaan diberikan larutan Natrium Diklofenak dengan
dosis yang telah dikonversikan dosis manusia ke dosis tikus terhadap dosis lazim 25 mg.
3. Masing-masing hewan percobaan diambil urinnya dengan interval waktu 6; 12; 18; 24 dan 30 jam.
4. Setiap waktu pengambilan cuplikan, volume urin yang diekskresikan dicatat dan disimpan dalam vial.
5. jika urin tidak segera dianalisis, disimpan dalam lemari es sampai analisis dikerjakan, urin dapat ditambahkan toluen toluen mencegah oksidasi urin.
6. Dipipet 0,5 ml urin yang telah ditampung dalam vial, lalu dimasukkan dalam tabung sentrifuge yang telah berisi 1 ml TCA 20, lalu divorteks dan
disentrifuge pada 3000 rpm selama 10 menit, ambil supernatant kemudian diukur absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 276 nm.
Universitas Sumatera Utara
27
3.9.2 Perlakuan Pada Hewan Percobaan dengan Pemberian Natrium Diklofenak dengan Pemberian EERK selama 7 Hari Berturut-turut
Perlakuan Pada Hewan Percobaan dengan Pemberian Natrium Diklofenak dengan Pemberian EERK selama 7 Hari Berturut-turut adalah sebagai berikut:
1. Pada kelompok perlakuan masing-masing hewan diberi ekstrak rimpang kencur dengan dosis 20 mgkg bb, 40 mgkg bb, 80 mgkg bb selama 7 hari berturut-
turut. 2. Kemudian hewan uji diatas pada hari ke-7 setelah 4 jam pemberian ekstrak
rimpang kencur diberi larutan obat natrium diklofenak dengan dosis yang telah dikonversikan dosis manusia ke dosis tikus terhadap dosis lazim 25 mg.
3. Masing-masing hewan uji diambil urinnya dengan interval waktu 6; 12; 18; 24 dan 30 jam.
4. Setiap waktu pengambilan cuplikan, volume urin yang diekskresikan dicatat dan disimpan dalam vial.
5. jika urin tidak segera dianalisis, disimpan dalam lemari es sampai analisis dikerjakan, urin dapat ditambahkan toluene toluen mencegah oksidasi urin.
6. Dipipet 0,5 ml urin yang telah ditampung dalam vial, lalu dimasukkan dalam tabung sentrifuge yang telah berisi 1 ml TCA 20, lalu divorteks dan
disentrifuge pada 3000 rpm selama 10 menit, ambil supernatant kemudian diukur absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 276 nm.
Universitas Sumatera Utara
28
3.10 Analisis data
Data hasil penelitian ini dianalisis secara statistik menggunakan metode ANAVA analisis variansi dengan program SPSS dengan tingkat kepercayaan
95, dilanjutkan dengan uji metode Tukey untuk mengetahui kelompok mana yang mempunyai pengaruh sama atau berbeda satu dengan yang lainnya.
Universitas Sumatera Utara
29
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Simplisia dan Ekstrak
Berdasarkan identifikasi yang dilakukan di “Laboratorium Herbarium” Laboratorium Penelitian Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara,
Medan identitas sampel tumbuhan yang diteliti adalah Kaempferia galanga, L Suku Zingiberaceae yang dikenal masyarakat dengan nama Kencur. Hasil
identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1 .
Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia rimpang kencur yaitu, bentuk pipih, bagian luar berwarna coklat kemerahan, bagian dalam berwarna putih
kekuningan sampai kecoklatan, bagian tepi berombak dan berkeriput. Hasil pemerikasaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia tumbuhan rimpang kencur
mempunyai warna putih kecoklatan sampai coklat dimana terdapat parenkim, parenkim yang berisi sel minyak, pembuluh kayu dengan penebalan spiral,
terdapat periderm, periderm dengan parenkim, serta pembuluh kayu dengan penebalan spiral, dan butir pati yang mempunyai bentuk bulat seperti telur.
Universitas Sumatera Utara
Kategori