23
polietersulfon steril 0,2 μm Nalgene, Nebauer Haemocytometer, mikroskop
inverted Olympus, ELISA reader SLT, magnetic stirer, dan kamera digital.
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi
tumbuhan
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian adalah umbi rumput teki Cyperus Rotundus L.. Tumbuhan teki Cyperus Rotundus L. telah
dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, menggunakan acuan baku Flora
of Java Backer dan Bakuizen van den Brink, 1965.
2. Preparasi sampel
Umbi Teki dikumpulkan dari daerah Sumberarum, Moyudan, Sleman tepi sungai Progo pada bulan Juni 2006. Umbi teki dibersihkan dicuci dengan air
mengalir, kemudian dikeringkan dengan sinar matahari tutup kain hitam atau di oven dengan suhu max 70
°C. Simplisia kering kemudian diserbuk dengan lebar nominal lubang penggilingan 0,75 mm ayakan 18 mesh, serbuk disimpan dalam
botol coklat. Ekstrak etanol umbi teki diperoleh dengan cara ekstraksi menggunakan
pelarut etanol 70 dengan cara maserasi. Untuk setiap 50 g serbuk digunakan 450 ml etanol 70. Ekstraksi dilakukan dalam bejana maserasi selama 2 hari
terlindung dari cahaya sambil sering diaduk. Setelah itu dienaptuangkan dan disaring, ampas diperas. Ekstrak tersebut selanjutnya diuapkan sampai diperoleh
ekstrak pekat dan disimpan dalam refrigerator sebelum digunakan. Ekstrak siap diujikan pada sel HeLa.
24
Pembuatan larutan uji Ekstrak etanol yang sudah difreezed dry diambil 150 mg dilarutkan
dengan DMSO 500 μl sehingga didapat larutan stok 300 mgml. Disini perlu ada
penambahan DMSO karena ekstrak tidak larut dalam air. Fungsi DMSO untuk meningkatkan kelarutan. Larutan uji disaring dengan filter 0,2
μm dan dimasukkan dalam conical steril, ditutup dengan alumunium foil dan disimpan
dalam lemari es. Selanjutnya dibuat seri kadar ekstrak 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 2000
μgml dari larutan stok dalam media RPMI. Pembuatan larutan uji dilakukan dalam Laminair Air Flow Cabinet secara aseptis.
3. Preparasi sel HeLa
a. Propagasi sel HeLa Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37 C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul
dibuka dan sel HeLa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan
dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian
dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 20 FBS. Disuspensikan secara perlahan
sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37
C dengan aliran 5 CO
2
dan 95 O
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
b. Panen sel HeLa Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, media
diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel
dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan
dibuang dan pelet diresuspensikan perlahan dengan 1 ml media. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah
medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x10
4
200 l dan siap dipakai untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook
et al, 1989.
4. Uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT
