berasal dari ibu hamil sehat adalah tipe VI 27,3, V 18,2, IV 9,1 dan NT nontypable 45,. Hasil penelitian tersebut berbeda dengan penelitian ini
karena pada penelitian tersebut tidak dijumpai adanya serotipe III, VII dan VIII seperti yang dijumpai pada penelitian ini. Sedangkan serotipe IV dan V yang
dijumpai pada penelitian tersebut tidak dijumpai pada penelitian ini. Dengan demikian dijumpai adanya perubahan dalam distribusi serotipe. Lin et al. 1998
dan Blumberg et al. 1996 juga melaporkan adanya perubahan serotipe SGB dari waktu ke waktu. Pada awal tahun 1990-an, serotipe V ditemukan sebagai serotipe
baru di Amerika Serikat dan negara-negara lain. Di Amerika Serikat dilaporkan bahwa distribusi serotipe SGB yang paling
sering muncul adalah serotipe Ia dan III Lin et al. 1998. Di Jepang serotipe VIII dan VI adalah serotipe yang paling sering muncul Lachenauer et al. 1999.
Menurut Lin et al. 1998 distribusi serotipe dipengaruhi oleh lokasi geografi, oleh karena itu perlu dilakukan serotyping pada suatu wilayah. Vormulasi vaksin
multivalen dari kapsul polisakarida yang ditujukan untuk suatu wilayah sangat ditentukan oleh distribusi serotipe di wilayah tersebut.
Antigen polisakarida pada permukaan bakteri SGB berdasarkan serologi terdiri dari serotipe Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII dan VIII. Penentuan serotipe
tersebut didasarkan pada komposisi antigen polisakarida spesifik-tipe pada permukaan bakteri yang tersusun dari galaktosa, glukosa, N-asetil glukosamin
dan asam N-asetilneuraminik sialic acid = asam sialat. Perbedaan masing- masing serotipe terletak pada rantai tulang punggung dan ikatan rantai antar
cabang gugus polisakarida serta ketebalan kandungan asam sialatnya Tissi et al. 1998.
4.4 Penentuan Hialuronidase 4.4.1 Uji Plate Agar-Hyaluronidase
Dari 10 isolat SGB yang diskrining dengan uji plate agar-hyaluronidase semuanya menunjukkan reaksi positip dengan adanya zona bening disekitar
pertumbuhan bakteri Gambar 8. Hal ini menunjukkan bahwa semua isolat SGB memperlihatkan adanya aktivitas hialuronidase sebagai enzim ekstraselulernya.
Hal serupa juga dilaporkan oleh Crist 1989 dimana dari 5 isolat SGB yang diuji
plate agar-hyaluronidase semuanya menunjukkan reaksi positip, sedangkan
Granlund et al. 1997 melaporkan 19 dari 22 isolat SGB dari kolonisasi vagina dan 5 dari 13 isolat endokarditis memperlihatkan produksi hialuronidase pada uji
plate.
Gambar 8. Uji Plate Agar-Hyaluronidase. Reaksi positip ditunjukkan dengan adanya zona bening disekitar pertumbuhan bakteri
2 dan 3.
4.4.2 Purifikasi Hialuronidase
Dari hasil skrining di atas, diambil satu isolat SGB yaitu isolat SV-14 untuk dilakukan purifikasi. Hasil purifikasi tersebut kemudian dilakukan penentuan
kadar protein, pengujian aktivitas dan karakterisasi hialuronidase. Penentuan Kadar Protein dan Aktivitas Hialuronidase
Hasil penentuan kadar protein dan aktivitas hialuronidase SGB SV-14 dapat dilihat pada tabel 7 di bawah.
Tabel 7. Hasil Uji Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik Hialuronidase Tahap
pemurnian Volume
ml Total
protein mg
Konsentrasi Protein
mgml Total
Aktivitas Unitml
Aktivitas spesifik
Unitmg Ekstrak Kasar
100 506
5.06 0.600
0.0012 NH
4 2
SO
4
45 5
31.10 6.22
0.391 0.0126
Dialisa 5
29.38 5.88
0.366 0.0125
Filtrasi Gel 1
2.30 2.30
0.074 0.0322
Dari tabel 7 di atas dapat dilihat bahwa konsentrasi protein dalam supernatan perbenihan SGB SV-14 dengan menggunakan metode Bradford adalah sebesar
5.06 mgml, sedangkan aktivitas spesifiknya menggunakan metode Bergmeyer 1987 adalah sebesar 0.0012 Umg. Sementara itu Afifi et al. 1993 melaporkan
bahwa konsentrasi protein dalam serum manusia sebelum mengalami purifikasi adalah sebesar 86 mgml, sedangkan aktivitas spesifik hialuronidasenya adalah
sebesar 0.009 Umg. Hasil optimisasi konsentrasi amonium sulfat diperoleh aktivitas
hialuronidase SGB tertinggi dicapai pada pengendapan dengan amonium sulfat konsentrasi 45. Hasil uji konsentrasi protein pada konsentrasi amonium sulfat
45 adalah sebesar 6.22 mgml dengan aktivitas spesifik hialuronidase yaitu sebesar 0.0126 Umg. Sementara itu setelah mengalami proses dialisis,
konsentrasi protein adalah sebesar 5.88 mgml dengan aktivitas spesifik hialuronidase 0.0125 Umg. Proses dialisis dilakukan untuk menghilangkan
molekul garam amonium sulfat dan ion-ion pengganggu lainnya yang berpengaruh terhadap kestabilan molekul protein enzim.
Hasil uji aktivitas spesifik hialuronidase SGB SV-14 dengan kromatografi filtrasi gel dalam sephadex G-100 tertinggi dijumpai pada fraksi ke-5 yaitu
sebesar 0.032 Umg dengan konsentrasi protein total sebesar 2.3 mgml. Konsentrasi protein dalam serum manusia setelah mengalami purifikasi tahap
pertama dalam DEAE-cellulose adalah sebesar 5.20 mgml dengan aktivitas spesifik hialuronidase 0.059 Umg, namun setelah mengalami purifikasi tahap ke
dua dalam FPLC-Superose-12 aktivitas spesifik meningkat menjadi 53 Umg Afifi et al. 1993.
Hialuronidase dapat dikelompokkan menjadi 3 katagori berdasarkan organisme penghasilnya yaitu: 1 tipe testikuler hyaluronate-4-
glycanohydrolases , 2 hyaluronate-3-glycanohydrolases dari lintah, cacing dan
ular, 3 hialuronidase bakterial hyaluronat lyase. Hialuronidase tipe testikular selain dihasilkan di testis juga dihasilkan di hati, paru, ginjal, placenta, otak dan
kulit. Hyaluronat lyase diproduksi oleh beberapa jenis mikroorganisme gram positip seperti Streptococcus grup A, B, C, G dan L serta Streptokokus sanguis,
stafilokokus, clostridium, propionibakterium dan streptomyces. Enzim tersebut
dikaitkan dengan virulensi bakteri karena memotong komponen utama matriks ekstraseluler jaringan tubuh yaitu asam hialuronat hialuronan, menghasilkan
dimer N-asetilglukosamin dan asam glukuronat. Saat ini gen-gen hialuronidase dari beberapa organisme tersebut telah disekuen Pritchard dan Lin 1993; Afifi et
al . 1993; Pritchard et al. 1994; Hynes et al. 2000; Kudo dan Tu 2001.
Hialuronidase bakteri berbeda dengan hialuronidase bisa ular dan testikular sapi. Kebanyakan hialuronidase bakteri kecuali streptomyces, menghasilkakn
disakarida sebagai produk akhir hidrolisis hialuronan. Hialuronidase dari bisa ular dan testikular sapi menghasilkan produk campuran heksa- dan tetrasakarida
sebagai produk hidrolisisnya. Selain itu hialuronidase bisa ular kurang aktivitas exo-glycosidase
nya karena enzim ini gagal menghidolisa p-nitrophenyl- β-D-
glucuronide dan p-nitrophenyl-N-acetyl-
β-D-glucosamide. Hialuronidase bisa ular dan hialuronidase testikular sapi selain mempunyai persamaan dalam hal
produk akhir hidrolisis, mempunyai perbedaan yang menyolok dalam hal spesifisitas substrat. Hialuronidase sapi selain menghidrolisis hialuronan juga
menghidrolisis kondroitin, kondroitin sulfat A, C, D dan E. Hialuronidase bisa ular hanya spesifik terhadap hialuronan Kudo dan Tu 2001.
4.4.3 Penentuan Berat Molekul Hialuronidase SGB
Hasil penentuan berat molekul hialuronidase SGB SV-14 dengan SDS- PAGE dapat dilihat pada Gambar 9.
1 2 3 4 5 Marker kD
Gambar 9. Hasil SDS-PAGE Hialuronidase SGB. Fraksi ke 5 pemurnian Sephadex G-100 1, hyaluronat lyase standar 2, hyaluronidase
pada supernatan 3, pengendapan 45 NH
4 2
SO
4
4, dialisa 5.
200
116 97.4
66 45
Dari Gambar 9 di atas dapat dilihat bahwa sumur 1 yang merupakan hasil SDS-PAGE hialuronidase yang telah dipurifikasi dengan kromatografi filtrasi gel
dalam Sephadex G-100 menujukkan adanya dua pita dengan berat molekul sekitar 100 kD. Pita-pita tersebut salah satunya diperkirakan merupakan pita
hialuronidase SGB, hal ini ditandai dengan tingginya aktivitas hialuronidase pada fraksi tersebut. Enzim standar hyaluronat lyase sumur 2 menunjukkan satu pita
dengan berat molekul yaitu sekitar 100 kD. Sumur 3 yang merupakan protein dalam supernatan menunjukkan adanya pita-pita protein yang berukuran besar
97,4 – 200 kD. Menurut Pritchard et al. 1994 hialuronidase SGB memiliki ukuran berat molekul sekitar 100 kD, dengan demikian diperkirakan pita-pita
yang muncul salah satunya adalah pita dari hialuronidase. Streptokokus grup B strain 3502 dengan serotipe III menghasilkan hialuronidase dalam kadar yang
tinggi dalam medium minimal dan tumbuh pada fase mid-log dimana material yang memiliki berat molekul tinggi dikeluarkan dalam medium kultur yang
diperoleh dengan ultrafiltrasi. Hasil PAGE enzim tersebut yang dimurnikan dengan afinitas kromatografi pada kolum yang didesain khusus mengandung N-
p-aminophenyl oxamic acid yang terikat pada agarose menunjukkan pita yang jelas pada 100 kDa. Pita tersebut diperkirakan adalah pita hialuronidase
Pritchard dan Lin 1993
4.5 Uji Patogenisitas SGB
