29 air 5-6 kali dengan 1-2 ml air. Air cuciannnya dimasukan ke dalam alat
destilasi dan ditambahkan dengan 8-10 ml larutan NaOH – Na
2
S
2
O
3
. Di bawah kondensor diletakan erlenmeyer yang berisi 5 ml
larutan H
3
BO
3
3 dan 3 tetes indikator campuran 2 bagian merah metil 0.2 dalam alkohol. Ujung tabung kondensor harus terendam
dalam larutan H
3
BO
3
kemudian isi erlemeyer diencerkan sampai 50 ml lalu dititrasi dengan HCl 0.02 N sampai terjadi perubahan warna
menjadi abu-abu. Dilakukan pula terhadap blanko.
100 007
. 14
X Contoh
mg X
HCl N
X blanko
HCL ml
contoh HCl
ml N
Protein= N X 6.25
c. Analisis Total Karotenoid Zakaria et al., 2000
Sebanyak 0.25 gram sampel diekstrak dengan 5 ml heksan:aseton 1:1 tiga kali dan disaring vakum dengan kertas Whatman 42.
Ekstraksi diulang beberapa kali hingga kertas saring dan residu menjadi jernih. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung bertutup dan
dievaporasi dengan rotavapor. Residu yang telah kering kemudian disaponifikasi dengan menambahkan 4 ml KOH 5 dalam metanol,
divorteks dan dilakukan sonifikasi selama 30 detik. Ekstrak dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 70°C selama 30 menit,
kemudian didinginkan dan ditambahkan 4 ml air bebas ion dan 8 ml heksan. Setelah itu, ekstrak divorteks dan disentrifus pada 2000 rpm
selama 5 menit hingga terbentuk fase organik dan fase air. Fase air ditambahkan 6 ml heksan, divorteks, dan disentrifus kembali pada
2000 rpm selama 5 menit. Fase organik yang terbentuk selanjutnya dikumpulkan.
Fase organik yang diperoleh kemudian kemudian ditambahkan dengan 3 ml asam asetat 5, divorteks dan disentrifus pada 2000 rpm
selama 5 menit. Lapisan atas fase organik diambil, dipindahkan dalam tabung bertutup dan dievaporasi dengan rotavapor prosedur asli
30 menggunakan gas nitrogen untuk mengevaporasi. Untuk menghitung
total karotenoid, residu kering dilarutkan dalam 4 ml heksan dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 450 nm. Sebagai blanko digunakan heksan. Prosedur analisis dapat dilihat pada Gambar 7.
Total karotenoid dihitung dengan rumus:
C= A450 x x
x FP
Keterangan: E1
= Nilai koefisien ekstingsi dari 1 larutan β-karoten 10
µgµl pada λ 450 nm= 2600
C = Konsentrasi total karotenoid µgg
A450 = Nilai absorbansi yang diperoleh pada
λ=450 nm FP
= Faktor pengenceran
d. Analisis
β-karoten Zakaria et al., 2000 1.
Pembuatan Larutan Standar Β-karoten
Sebanyak 1 mg standar β-karoten dilarutkan dalam 2 ml
kloroform, divorteks, ditambahkan 6 ml metanol dan divorteks kembali. Sebanyak 0.5 ml larutan diambil dan diencerkan sebanyak
sepuluh kali dengan fase gerak HPLC. Selanjutnya diukur absorbansi
pada panjang
gelombang 450
nm dengan
spektrofotometer dan sebagai blanko digunakan larutan fase gerak HPLC. Larutan standar
β-karoten kemudian disuntikkan ke dalam kolom HPLC.
Konsentrasi standar β-karoten dihitung dengan rumus:
10 mgmL E1 = X 1µg1µLA450
Keterangan: E1 = Nilai koefisien ekstingsi dari 1 larutan
β-karoten 10
mgml pada λ 450 nm= 2600 X
= Konsentrasi standar β-karoten µgµL
31 A450 = Nilai absorbansi yang diperoleh pada µ 450 nm
Nilai X dikalikan dengan kemurnian standar β-karoten
yang diperoleh dari analisis HPLC.
2. Persiapan dan Ekstraksi Karotenoid
