Alat dan Bahan .1 Alat Prosedur Penelitian

22

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimen, meliputi pembuatan sediaan gel ketoprofen dengan basis gel alginat yang dibuat dalam 12 formula gel menggunakan peningkat penetrasi enhancer gliserin, etanol dan campuran gliserin dengan etanol, kemudian dibandingkan dengan gel ketoprofen merk dagang, dan diukur laju difusi dari masing-masing enhancer menggunakan sel difusi. Jumlah ketoprofen terpenetrasi kedalam larutan dapar fosfat pH 7,4 ditentukan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260,20 nm. Semua pengujian masing-masing formula diulangi sebanyak 3 kali dan dilakukan selama 10 jam. 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat Sel difusi yang terdiri dari sel donor dan sel reseptor dengan volume masing-masing 10,8 mL dan luas area efektif untuk penetrasi 1,29 cm 2 diameter 1,28 cm, spektrofotometer UV-1800 Shimadzu Spectrophotometer, magnetic stirrer Hanna,magnetic bar,pH meter Hanna, mikrometer sekrup Delta corporation, penunjuk waktu stopwatch, neraca analitik Boeco, lumpang dan stamfer, gelas ukur 250 mL Pyrex, beaker gelas 300 mL Pyrex, labu tentukur 1000mL Pyrex, labu tentukur 50mL Pyrex, labu tentukur 25 mL Pyrex, maat pipet 1 mL Pyrex, maat pipet 10mL Pyrex, termostat MGW Lauda, lemari pembeku bersuhu sangat rendahGlacier Nuaire, termometer, gelas arloji, dan batang pengaduk. Universitas Sumatera Utara 23

3.1.2 Bahan

Ketoprofen Dexa Medica, kalium dihidrogen fosfat, etanol, gliserin, kalsium klorida, metil paraben, natrium hidroksida dan natrium klorida Merck, natrium alginat Wako pure chemical industries, Ltd Japan, dan akuades.

3.2 Prosedur Penelitian

3.2.1 Pembuatan pereaksi 3.2.1.1 Pembuatan akuades bebas karbon dioksida Akuades dididihkan kuat-kuat selama 5 menit atau lebih dan didiamkansampai dingin dan tidak boleh menyerap karbon dioksida dari udara Ditjen,POM., 1995.

3.2.1.2 Pembuatan larutan natrium hidroksida 0,2 N

Natrium hidroksida sebanyak 8 gram dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 1000 mL Ditjen, POM., 1995.

3.2.1.3 Pembuatan larutan natrium klorida 0,9 bv

Natrium klorida sebanyak 9 gram dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 1000 mL Ditjen, POM., 1995.

3.2.1.4 Pembuatan medium dapar fosfat pH 7,4

Kalium dihidrogen fosfat sebanyak 6,8 gram dilarutkan dalam 250 mL air suling bebas CO 2 ,lalu ditambahkan natrium hidroksida 0,2 N sebanyak 195,5 mL,lalu ditambahkan air bebas karbondioksida hingga volumenya 1000 mL Ditjen, POM.,1995. Universitas Sumatera Utara 24 3.2.2 Pembuatan kurva serapan dan kurva kalibrasi larutan ketoprofen dalam medium dapar fosfat pH 7,4

3.2.2.1 Pembuatan larutan induk baku ketoprofen

Ketoprofen ditimbang sebanyak 5 mg dan dimasukkan kedalam labu ukur 50mL, ditambahkan medium pH 7,4, dikocok hingga larut dicukupkan volume dengan medium pH 7,4 sampai garis tanda. Konsentrasi ketoprofen adalah 100 mcgmL larutan induk baku I. Dari larutan induk baku I dipipet sebanyak 10 mL ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan medium pH 7,4 sampai garis tanda. Konsentrasi ketoprofen adalah 40 mcgmg.

3.2.2.2 Pembuatan kurva serapan ketoprofen

Larutan induk baku dipipet 6mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 25mL kemudian dicukupkan volume dengan medium pH 7,4 sampai garis tanda, dikocok sampai homogen. Konsentrasi ketoprofen adalah 9,6mcgmL. Diukur serapannya dengan spektrofotometer uv pada panjang gelombang 200-400 nm.

3.2.2.3 Pembuatan kurva kalibrasi ketoprofen

Dari larutan induk baku tersebut dibuat larutan ketoprofen dengan berbagai konsentrasi yaitu: 0,14; 0,18; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2 dan 1,4mcgmL dengan memipet larutan induk baku masing-masing 0,08; 0,11; 0,25; 0,37; 0,50; 0,62; 0,75 dan 0,87mL dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL kemudian dicukupkan volume dengan medium pH 7,4 sampai garis tanda, dikocok sampai homogen. Diukur serapannya dengan spektrofotometer uv pada panjang gelombang 260,20 nm . .

3.2.3 Penyiapan membran biologis dari kulit kelinci

Pada penelitian ini digunakan kulit dari kelinci jantan dengan berat Universitas Sumatera Utara 25 berkisar antara 1,5-2 kg. Rambut pada daerah abdomen dicukur dengan hati-hati sehari sebelum pengambilan kulit untuk mengkondisikan kulit sesuai lingkungan menggunakan pisau cukur Gillette Goal. Kelinci dimatikan dengan cara dibius dengan dietil eter dan kulit bagian abdomen dipotong dengan gunting bedah. Dibersihkan lemak yang menempel, dicuci dengan akuades, dibungkus dengan aluminium foil, dan disimpan segera pada suhu -50ºC lemari pembeku bersuhu sangat rendah, Nuaire, Japan sampai eksperimen dilakukanAkhtar, et al., 2011. Pada waktu kulit mau dipakai direndam dengan NaCl 0,9 selama satu malam untuk memastikan agar proses hidrasi berlangsung sempurna Janan, et al., 1995.

3.2.4 Pembuatan gel dasar alginat

Komposisi dasar: R Kalsium klorida 0,025 g Natrium alginat 1,5 g Metil paraben 0,01 g Akuades ad 50 g Ditimbang natrium alginat sebanyak 1,5 g, ditaburkan di atas akuades secukupnya, dibiarkan selama 1 malam hingga mengembang. Ditambahkan kalsium klorida yang telah dilarutkan dalam akuades, dan ditambahkan metil paraben yang telah dilarutkan dalam air panas. Gerus hingga homogen dan masukkan ke dalam pot plastik Bangun, 2001.

3.2.5 Pembuatan gel ketoprofen

Komposisi formula gelketoprofen tanpa dan dengan berbagai peningkat penetrasi dapat dilihat pada Tabel 3.1. Universitas Sumatera Utara 26 Tabel 3.1 Komposisi formula gelketoprofen tanpa dan dengan berbagai peningkat penetrasi FORMULA F Nama obat Nama peningkat penetrasi Basis gel alginat ad g Ketoprofen g Etanol g Gliserin g F1 Tanpa enhancer 0,05 - - 2 F2 Gliserin 45 0,05 - 0,9 2 F3 Gliserin 50 0,05 - 1,0 2 F4 Gliserin 55 0,05 - 1,1 2 F5 Gliserin 60 0,05 - 1,2 2 F6 Etanol 3 0,05 0,06 2 F7 Etanol 5 0,05 0,1 2 F8 Etanol 7 0,05 0,14 2 F9 Etanol 3 gliserin 45 0,05 0,06 0,9 2 F10 Etanol 5 gliserin 45 0,05 0,1 0,9 2 F11 Etanol 7 gliserin 45 0,05 0,14 0,9 2 F12 Etanol 5 gliserin 55 0,05 0,1 1,1 2 Ditimbang semua bahan. Dimasukkan ketoprofen ke dalam lumpang dan digerus. Tambahkan peningkat penetrasi kecuali pada formula 1, lalu gerus homogen. Kemudian tambahkan dasar gel natrium alginat sedikit demi sedikit, gerus homogen, lalu masukkan dalam pot plastik.

3.2.6 Pengujian penetrasi ketoprofen dalam sediaan gelsecarain vitro

Untuk pengujian gelketoprofen, membran biologis kulit kelinci dengan luas 4 cm 2 panjang = 2 cm ; lebar 2 cm dan tebal 0,30 mm dipasangkan pada sel difusi yang berdiameter 1,3 cm bagian reseptor yang terlebih dahulu diolesi pelumas silikon kemudian diolesi 0,1 g gelketoprofen. Dihubungkan bagian donor dan reseptor dengan karet. Selanjutnya dimasukkan magnetic bar ke dalam bagian reseptor serta larutan dapar fosfat pH 7,4 sampai batas tanda. Sel difusi dijaga pada suhu 37ºC selama percobaan. Pada interval waktu tertentu dipipet sebanyak 1 mL aliquot dari medium reseptor dan digantikan segera dengan 1 mL larutan dapar fosfat pH 7,4 untuk mempertahankan volume medium reseptor tetap pada Universitas Sumatera Utara 27 10,8 mL. Sebanyak 1 mL aliquot yang didapat pada setiap pemipetan diencerkan 25 kali, dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260,20 nm. Setiap pengujian dilakukan selama 10 jam dan diulangi sebanyak 3 kali. Skema uji penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci secara in vitro dapat dilihat pada Gambar 3.1. Donor Reseptor Membran biologis Batangan magnet Gambar 3.1Skema uji penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci secara in vitro

3.2.7 Analisa statistik

Semua data yang diperoleh dianalisa dengan one way ANOVA kemudian dilanjutkan dengan Uji Post Hoc yang dianalisa dengan Tukey HSD menggunakan program SPSS versi 17. Universitas Sumatera Utara 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengaruh Konsentrasi Gliserin Terhadap Penetrasi Ketoprofen Melalui Kulit Kelinci Secara In Vitro Pengaruh konsentrasi gliserin dalam formula gel terhadap penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan nilai AUC ketoprofen yang berpenetrasi dari masing-masing formula ke dalam medium dapar fosfat pH 7,4 pada suhu 37 C dapat dilihat pada Tabel 4.1. Gambar 4.1Pengaruh gliserin terhadap penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci dari gel alginat dalam medium dafar fosfat pH 7,4 pada suhu 37 C secara in vitro Tabel 4.1 Nilai AUC gel dari formula dengan enhancer gliserin dan tanpa enhancer No. Formula AUC 0-10 jam .menit 1 F1 4788,70± 642,01 2 F2 8070,13± 226,33 3 F3 9007,60± 255,71 4 F4 11879,29± 329,35 5 F5 7103,25 ± 148,86 Keterangan:F1 = Tanpa enhancer F2 = Gel alginat yang mengandung Gliserin 45 F3 = Gel alginat yang mengandung Gliserin 50 F4 = Gel alginat yang mengandung Gliserin 55 F5 = Gel alginat yang mengandung Gliserin 60 200 400 600 800 1000 1200 15 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 Ju m lah k et op rof en yan g b erp en et ra si mc g Waktu menit F1 Tanpa enhancer F2 Gliserin 45 F3 Gliserin 50 F4 Gliserin 55 F5 Gliserin 60 Universitas Sumatera Utara 29 Dalam Gambar 4.1 dan Tabel 4.1 menunjukkan bahwa jumlah ketoprofen yang berpenetrasi ke medium penerima lebih besar pada formula yang mengandung enhancer gliserin daripada formula yang tidak mengandung enhancerdan berdasarkan nilai AUC perbedaan ini adalah signifikan dalam uji statistik One Way ANOVA, P 0,05, uji Post Hoc dianalisis dengan Tukey. Semakin besar konsentrasi gliserin yang digunakan, semakin besar pula jumlah ketoprofen yang berpenetrasi, kecuali pada F5 dengan konsentrasi 60, jumlah ketoprofen yang berpenetrasi menurun. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Desma 2015 terhadap indometasin dimana penetrasi tertinggi terdapat pada formula dengan gliserin 55 dan terjadi penurunan pada konsentrasi 60. Berdasarkan nilai AUC dalam uji statistik One Way ANOVA, P 0,05, uji Post Hoc dianalisis dengan Tukey terdapat perbedaan yang signifikan pada berbagai konsentrasi gliserin yang digunakan, yaitu F2 berbeda secara signifikan dengan F3, F4 dan F5, F3 juga berbeda signifikan dengan F4, F5 dan F4 dengan F5 juga terdapat perbedaan yang signifikan. Gliserin memiliki kemampuan sebagai faktor pelembab alami yang mampu melindungi kulit dari kekeringan dengan cara melembutkan permukaan stratum corneum dan juga mampu meningkatkan kondisi hidrasi kulitBjorklund, et al., 2013. Peningkatan hidrasi kulit akan menyebabkan pembengkakan dan membuka struktur stratum corneum sehingga memudahkan obat berpartisi ke dalam membran Benson, 2005. Pada keadaan normal, kandungan air dalam lapisan tanduk rendah, 5-15, tetapi dapat ditingkatkan sampai 50 dengan pengolesan pembawa pada permukaan kulit yang dapat menyumbat kulit. Stratum korneum yang lembab atau mempunyai afinitas yang sama terhadap senyawa-senyawa yang larut dalam air Universitas Sumatera Utara 30 dalam lipida Aiache, dkk., 1993. Pengaruh konsentrasi gliserin dalam formula gel terhadap penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci ke dalam medium dapar fosfat pH 7,4 pada suhu 37 C dan pada menit ke-300 dapat dilihat pada Gambar 4.2. Gambar 4.2 Pengaruh konsentrasi gliserin terhadap penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci dari gel alginat dalam medium dafar fosfat pH 7,4 pada suhu 37 C secara in vitro pada menit ke-300 Dalam Gambar 4.2 menunjukkan bahwa jumlah ketoprofen yang berpenetrasi cenderung meningkat dengan meningkatnya konsentrasi gliserin sampai 55, tetapi pada konsentrasi 60 jumlah ketoprofen yang berpenetrasi menurun. Penambahan gliserin pada sediaan topikal pada konsentrasi ≤ 30 berfungsi sebagai humektan Rowe, et al., 2009. Menurut Bisset, dkk 1984 gliserin sebagai pelembab kulit kering konsentrasi yang menguntungkan berada pada 20-40, sedangkan konsentrasi yang lebih tinggi yaitu 80-100 menunjukkan efek yang sama seperti petrolatum. Gliserin dapat meningkatkan penetrasi ketoprofen pada konsentrasi 40. Jumlah ketoprofen yang berpenetrasi semakin menurun pada konsentrasi 60. Hal ini disebabkan penambahan gliserin dengan konsentrasi 60 menghasilkan sediaan gel yang 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 10 20 30 40 50 60 70 ju m la h k et o p ro fen b erp en et ra si mc g Konsentrasi gliserin Universitas Sumatera Utara 31 kurang padat dibandingkan dengan konsentrasi lainnya sehingga gel kurang menempel pada kulit dan jumlah obat yang berpenetrasi berkurang. Gliserin memiliki tiga gugus hidroksil yang memungkinkan untuk menarik dan mengikat molekul air melalui pembentukan ikatan hidrogen yang kuat dan meningkatkan penyerapan air dari dermis ke epidermis. Di sisi lain hal ini dapat menyebabkan kehilangan air yang berlebihan melalui penguapan Wisderm, 2014. Kehilangan air pada kulit dapat menyebabkan kulit kering sehingga penetrasi obat berkurang. Gambar 4.2 menunjukkan bahwa dengan meningkatnya penetrasi ketoprofen tidak linier dengan bertambahnya konsentrasi gliserin.

4.2 Pengaruh Konsentrasi Etanol Terhadap Penetrasi Ketoprofen Melalui Kulit Kelinci Secara In Vitro