22
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimen, meliputi pembuatan sediaan gel ketoprofen dengan basis gel alginat yang dibuat dalam 12
formula gel menggunakan peningkat penetrasi enhancer gliserin, etanol dan campuran gliserin dengan etanol, kemudian dibandingkan dengan gel ketoprofen
merk dagang, dan diukur laju difusi dari masing-masing enhancer menggunakan sel difusi. Jumlah ketoprofen terpenetrasi kedalam larutan dapar fosfat pH 7,4
ditentukan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260,20 nm. Semua pengujian masing-masing formula diulangi sebanyak 3 kali dan
dilakukan selama 10 jam.
3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat
Sel difusi yang terdiri dari sel donor dan sel reseptor dengan volume masing-masing 10,8 mL dan luas area efektif untuk penetrasi 1,29 cm
2
diameter 1,28 cm, spektrofotometer UV-1800 Shimadzu Spectrophotometer, magnetic
stirrer Hanna,magnetic bar,pH meter Hanna, mikrometer sekrup Delta corporation, penunjuk waktu stopwatch, neraca analitik Boeco, lumpang dan
stamfer, gelas ukur 250 mL Pyrex, beaker gelas 300 mL Pyrex, labu tentukur 1000mL Pyrex, labu tentukur 50mL Pyrex, labu tentukur 25 mL Pyrex, maat
pipet 1 mL Pyrex, maat pipet 10mL Pyrex, termostat MGW Lauda, lemari pembeku bersuhu sangat rendahGlacier Nuaire, termometer, gelas arloji, dan
batang pengaduk.
Universitas Sumatera Utara
23
3.1.2 Bahan
Ketoprofen Dexa Medica, kalium dihidrogen fosfat, etanol, gliserin, kalsium klorida, metil paraben, natrium hidroksida dan natrium klorida Merck,
natrium alginat Wako pure chemical industries, Ltd Japan, dan akuades.
3.2 Prosedur Penelitian
3.2.1 Pembuatan pereaksi 3.2.1.1 Pembuatan akuades bebas karbon dioksida
Akuades dididihkan kuat-kuat selama 5 menit atau lebih dan didiamkansampai dingin dan tidak boleh menyerap karbon dioksida dari udara
Ditjen,POM., 1995.
3.2.1.2 Pembuatan larutan natrium hidroksida 0,2 N
Natrium hidroksida sebanyak 8 gram dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 1000 mL Ditjen, POM., 1995.
3.2.1.3 Pembuatan larutan natrium klorida 0,9 bv
Natrium klorida sebanyak 9 gram dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 1000 mL Ditjen, POM., 1995.
3.2.1.4 Pembuatan medium dapar fosfat pH 7,4
Kalium dihidrogen fosfat sebanyak 6,8 gram dilarutkan dalam 250 mL air suling bebas CO
2
,lalu ditambahkan natrium hidroksida 0,2 N sebanyak 195,5 mL,lalu ditambahkan air bebas karbondioksida hingga volumenya 1000 mL
Ditjen, POM.,1995.
Universitas Sumatera Utara
24
3.2.2 Pembuatan kurva serapan dan kurva kalibrasi larutan ketoprofen dalam medium dapar fosfat pH 7,4
3.2.2.1 Pembuatan larutan induk baku ketoprofen
Ketoprofen ditimbang sebanyak 5 mg dan dimasukkan kedalam labu ukur 50mL, ditambahkan medium pH 7,4, dikocok hingga larut dicukupkan volume
dengan medium pH 7,4 sampai garis tanda. Konsentrasi ketoprofen adalah 100 mcgmL larutan induk baku I. Dari larutan induk baku I dipipet sebanyak 10 mL
ke dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan medium pH 7,4 sampai garis tanda. Konsentrasi ketoprofen adalah 40 mcgmg.
3.2.2.2 Pembuatan kurva serapan ketoprofen
Larutan induk baku dipipet 6mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 25mL kemudian dicukupkan volume dengan medium pH 7,4 sampai garis tanda,
dikocok sampai homogen. Konsentrasi ketoprofen adalah 9,6mcgmL. Diukur serapannya dengan spektrofotometer uv pada panjang gelombang 200-400 nm.
3.2.2.3 Pembuatan kurva kalibrasi ketoprofen
Dari larutan induk baku tersebut dibuat larutan ketoprofen dengan berbagai konsentrasi yaitu: 0,14; 0,18; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2 dan 1,4mcgmL dengan
memipet larutan induk baku masing-masing 0,08; 0,11; 0,25; 0,37; 0,50; 0,62; 0,75 dan 0,87mL dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL kemudian dicukupkan
volume dengan medium pH 7,4 sampai garis tanda, dikocok sampai homogen. Diukur serapannya dengan spektrofotometer uv pada panjang gelombang 260,20
nm . .
3.2.3 Penyiapan membran biologis dari kulit kelinci
Pada penelitian ini digunakan kulit dari kelinci jantan dengan berat
Universitas Sumatera Utara
25 berkisar antara 1,5-2 kg. Rambut pada daerah abdomen dicukur dengan hati-hati
sehari sebelum pengambilan kulit untuk mengkondisikan kulit sesuai lingkungan menggunakan pisau cukur Gillette Goal. Kelinci dimatikan dengan cara dibius
dengan dietil eter dan kulit bagian abdomen dipotong dengan gunting bedah. Dibersihkan lemak yang menempel, dicuci dengan akuades, dibungkus dengan
aluminium foil, dan disimpan segera pada suhu -50ºC lemari pembeku bersuhu sangat rendah, Nuaire, Japan sampai eksperimen dilakukanAkhtar, et al., 2011.
Pada waktu kulit mau dipakai direndam dengan NaCl 0,9 selama satu malam untuk memastikan agar proses hidrasi berlangsung sempurna Janan, et al., 1995.
3.2.4 Pembuatan gel dasar alginat
Komposisi dasar: R
Kalsium klorida 0,025 g
Natrium alginat 1,5 g
Metil paraben 0,01 g
Akuades ad 50 g
Ditimbang natrium alginat sebanyak 1,5 g, ditaburkan di atas akuades secukupnya, dibiarkan selama 1 malam hingga mengembang. Ditambahkan
kalsium klorida yang telah dilarutkan dalam akuades, dan ditambahkan metil paraben yang telah dilarutkan dalam air panas. Gerus hingga homogen dan
masukkan ke dalam pot plastik Bangun, 2001.
3.2.5 Pembuatan gel ketoprofen
Komposisi formula gelketoprofen tanpa dan dengan berbagai peningkat penetrasi dapat dilihat pada Tabel 3.1.
Universitas Sumatera Utara
26
Tabel 3.1 Komposisi formula gelketoprofen tanpa dan dengan berbagai peningkat
penetrasi
FORMULA F
Nama obat Nama peningkat
penetrasi
Basis gel alginat ad g
Ketoprofen g
Etanol g Gliserin g
F1 Tanpa enhancer
0,05 -
- 2
F2 Gliserin 45
0,05 -
0,9 2
F3 Gliserin 50
0,05 -
1,0 2
F4 Gliserin 55
0,05 -
1,1 2
F5 Gliserin 60
0,05 -
1,2 2
F6 Etanol 3
0,05 0,06
2
F7 Etanol 5
0,05 0,1
2
F8 Etanol 7
0,05 0,14
2
F9 Etanol 3 gliserin 45
0,05 0,06
0,9 2
F10 Etanol 5 gliserin 45
0,05 0,1
0,9 2
F11 Etanol 7 gliserin 45
0,05 0,14
0,9 2
F12 Etanol 5 gliserin 55
0,05 0,1
1,1 2
Ditimbang semua bahan. Dimasukkan ketoprofen ke dalam lumpang dan digerus. Tambahkan peningkat penetrasi kecuali pada formula 1, lalu gerus
homogen. Kemudian tambahkan dasar gel natrium alginat sedikit demi sedikit, gerus homogen, lalu masukkan dalam pot plastik.
3.2.6 Pengujian penetrasi ketoprofen dalam sediaan gelsecarain vitro
Untuk pengujian gelketoprofen, membran biologis kulit kelinci dengan luas 4 cm
2
panjang = 2 cm ; lebar 2 cm dan tebal 0,30 mm dipasangkan pada sel difusi yang berdiameter 1,3 cm bagian reseptor yang terlebih dahulu diolesi
pelumas silikon kemudian diolesi 0,1 g gelketoprofen. Dihubungkan bagian donor dan reseptor dengan karet. Selanjutnya dimasukkan magnetic bar ke dalam bagian
reseptor serta larutan dapar fosfat pH 7,4 sampai batas tanda. Sel difusi dijaga pada suhu 37ºC selama percobaan. Pada interval waktu tertentu dipipet sebanyak
1 mL aliquot dari medium reseptor dan digantikan segera dengan 1 mL larutan dapar fosfat pH 7,4 untuk mempertahankan volume medium reseptor tetap pada
Universitas Sumatera Utara
27 10,8 mL. Sebanyak 1 mL aliquot yang didapat pada setiap pemipetan diencerkan
25 kali, dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260,20 nm. Setiap pengujian dilakukan selama 10 jam dan diulangi
sebanyak 3 kali. Skema uji penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci secara in vitro dapat
dilihat pada Gambar 3.1.
Donor Reseptor
Membran biologis
Batangan magnet
Gambar 3.1Skema uji penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci secara in vitro
3.2.7 Analisa statistik
Semua data yang diperoleh dianalisa dengan one way ANOVA kemudian dilanjutkan dengan Uji Post Hoc yang dianalisa dengan Tukey HSD menggunakan
program SPSS versi 17.
Universitas Sumatera Utara
28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pengaruh Konsentrasi Gliserin Terhadap Penetrasi Ketoprofen Melalui Kulit Kelinci Secara In Vitro
Pengaruh konsentrasi gliserin dalam formula gel terhadap penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan nilai AUC
ketoprofen yang berpenetrasi dari masing-masing formula ke dalam medium dapar fosfat pH 7,4 pada suhu 37
C dapat dilihat pada Tabel 4.1.
Gambar 4.1Pengaruh gliserin terhadap penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci
dari gel alginat dalam medium dafar fosfat pH 7,4 pada suhu 37 C
secara in vitro
Tabel 4.1 Nilai AUC gel dari formula dengan enhancer gliserin dan tanpa
enhancer
No. Formula
AUC 0-10 jam .menit
1 F1
4788,70± 642,01 2
F2 8070,13± 226,33
3 F3
9007,60± 255,71 4
F4 11879,29± 329,35
5 F5
7103,25 ± 148,86 Keterangan:F1 = Tanpa enhancer
F2 = Gel alginat yang mengandung Gliserin 45 F3 = Gel alginat yang mengandung Gliserin 50
F4 = Gel alginat yang mengandung Gliserin 55 F5 = Gel alginat yang mengandung Gliserin 60
200 400
600 800
1000 1200
15 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600
Ju m
lah k
et op
rof en
yan g
b erp
en et
ra si
mc g
Waktu menit
F1 Tanpa enhancer F2 Gliserin 45
F3 Gliserin 50 F4 Gliserin 55
F5 Gliserin 60
Universitas Sumatera Utara
29 Dalam Gambar 4.1 dan Tabel 4.1 menunjukkan bahwa jumlah ketoprofen
yang berpenetrasi ke medium penerima lebih besar pada formula yang mengandung enhancer gliserin daripada formula yang tidak mengandung
enhancerdan berdasarkan nilai AUC perbedaan ini adalah signifikan dalam uji statistik One Way ANOVA, P 0,05, uji Post Hoc dianalisis dengan Tukey.
Semakin besar konsentrasi gliserin yang digunakan, semakin besar pula jumlah ketoprofen yang berpenetrasi, kecuali pada F5 dengan konsentrasi 60, jumlah
ketoprofen yang berpenetrasi menurun. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Desma 2015 terhadap indometasin dimana penetrasi tertinggi terdapat
pada formula dengan gliserin 55 dan terjadi penurunan pada konsentrasi 60. Berdasarkan nilai AUC dalam uji statistik One Way ANOVA, P 0,05, uji Post
Hoc dianalisis dengan Tukey terdapat perbedaan yang signifikan pada berbagai konsentrasi gliserin yang digunakan, yaitu F2 berbeda secara signifikan dengan
F3, F4 dan F5, F3 juga berbeda signifikan dengan F4, F5 dan F4 dengan F5 juga terdapat perbedaan yang signifikan.
Gliserin memiliki kemampuan sebagai faktor pelembab alami yang mampu melindungi kulit dari kekeringan dengan cara melembutkan permukaan
stratum corneum dan juga mampu meningkatkan kondisi hidrasi kulitBjorklund, et al., 2013. Peningkatan hidrasi kulit akan menyebabkan pembengkakan dan
membuka struktur stratum corneum sehingga memudahkan obat berpartisi ke dalam membran Benson, 2005.
Pada keadaan normal, kandungan air dalam lapisan tanduk rendah, 5-15, tetapi dapat ditingkatkan sampai 50 dengan pengolesan pembawa pada
permukaan kulit yang dapat menyumbat kulit. Stratum korneum yang lembab atau mempunyai afinitas yang sama terhadap senyawa-senyawa yang larut dalam air
Universitas Sumatera Utara
30 dalam lipida Aiache, dkk., 1993.
Pengaruh konsentrasi gliserin dalam formula gel terhadap penetrasi ketoprofen melalui kulit kelinci ke dalam medium dapar fosfat pH 7,4 pada suhu
37 C dan pada menit ke-300 dapat dilihat pada Gambar 4.2.
Gambar 4.2 Pengaruh konsentrasi gliserin terhadap penetrasi ketoprofen
melalui kulit kelinci dari gel alginat dalam medium dafar fosfat pH 7,4 pada suhu 37
C secara in vitro pada menit ke-300 Dalam Gambar 4.2 menunjukkan bahwa jumlah ketoprofen yang
berpenetrasi cenderung meningkat dengan meningkatnya konsentrasi gliserin sampai 55, tetapi pada konsentrasi 60 jumlah ketoprofen yang berpenetrasi
menurun. Penambahan gliserin pada sediaan topikal pada konsentrasi ≤ 30
berfungsi sebagai humektan Rowe, et al., 2009. Menurut Bisset, dkk 1984 gliserin sebagai pelembab kulit kering konsentrasi yang menguntungkan berada
pada 20-40, sedangkan konsentrasi yang lebih tinggi yaitu 80-100 menunjukkan efek yang sama seperti petrolatum. Gliserin dapat meningkatkan
penetrasi ketoprofen pada konsentrasi 40. Jumlah ketoprofen yang berpenetrasi semakin menurun pada konsentrasi 60. Hal ini disebabkan
penambahan gliserin dengan konsentrasi 60 menghasilkan sediaan gel yang
50 100
150 200
250 300
350 400
450 500
10 20
30 40
50 60
70
ju m
la h
k et
o p
ro fen
b erp
en et
ra si
mc g
Konsentrasi gliserin
Universitas Sumatera Utara
31 kurang padat dibandingkan dengan konsentrasi lainnya sehingga gel kurang
menempel pada kulit dan jumlah obat yang berpenetrasi berkurang. Gliserin memiliki tiga gugus hidroksil yang memungkinkan untuk menarik dan mengikat
molekul air melalui pembentukan ikatan hidrogen yang kuat dan meningkatkan penyerapan air dari dermis ke epidermis. Di sisi lain hal ini dapat menyebabkan
kehilangan air yang berlebihan melalui penguapan Wisderm, 2014. Kehilangan air pada kulit dapat menyebabkan kulit kering sehingga penetrasi obat berkurang.
Gambar 4.2 menunjukkan bahwa dengan meningkatnya penetrasi ketoprofen tidak linier dengan bertambahnya konsentrasi gliserin.
4.2 Pengaruh Konsentrasi Etanol Terhadap Penetrasi Ketoprofen Melalui Kulit Kelinci Secara In Vitro