PEMBUATAN KURVA BAKU DAN KALIBRASI KURVA BAKU

3.3 METODE PENELITIAN

Metode penelitian meliputi 2 tahap, tahap pertama adalah uji pendahuluan untuk menetapkan kurva baku dari standar bovine IgG dan mencari kadar optimum sampel susu bubuk skim yang digunakan pada validasi pengujian. Tahap kedua adalah validasi metode analisis kadar IgG dalam susu bubuk yang dilaksanakan dengan parameter uji linieritas dan rentang, uji presisi, uji akurasi, limit deteksi dan limit kuantitasi dan spesifisitas. Pengujian kadar IgG dalam susu bubuk skim dilakukan terhadap 3 sampel susu bubuk yang mengandung IgG yang beredar dengan kadar yang berbeda kadar IgG :Sampel A: 150 mg15g, sampel B: 180 mg15g dan sampel C: 200 mg15g.

3.3.1 PEMBUATAN KURVA BAKU DAN KALIBRASI KURVA BAKU

Kurva baku harus dikalibrasi sebelum digunakan karena kurva baku merupakan suatu fungsi dari rentang nilai analisis, yang akan berhubungan dengan respon analit Chan, 2004, baku yang digunakan adalah larutan standar bovine IgG yang tersedia dalam kit reagen ELISA dengan kadar larutan stok 125ngml. Seri larutan baku dibuat dengan mengencerkan larutan standar bovine IgG 125ngml dengan assay diluent pada kadar: 125 ngml; 62.5 ngml; 31.25 ngml; 15.6 ngml; 7.8 ngml; dan 0 ngml. Kalibrasi kurva baku dengan membuat suatu seri larutan standar, replikasi 7 kali dan pembacaan hasil dilakukan 10 kali dengan rentang waktu pembacaan setiap 5 detik. Kurva baku yang valid diperoleh jika nilai r hasil pengukuran 0,95. Larutan pencuci wash bufer dilakukan pengenceran dengan air suling dengan perbandingan 1:10. Prosedur ELISA dilakukan mengacu pada prosedur dari manual kit Zeptometrix 2010. Prosedur uji dilakukan dengan cara menyiapkan microplate dan dipipet 200 l larutan standar ke dalam sumuran dilakukan duplo, microplate kemudian di tutup dengan tutup plastik, dan ditempatkan pada ELISA reader dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 o C. Microplate dicuci dengan wash buffer menggunakan volume 300 l tiap sumuran sebanyak 4x dan dikeringkan dengan cara membalik balik secara kuat microplate hingga tidak ada lagi droplet pada sumuran. Sejumlah 100 l detector antibody ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi larutan standard an sampel, microplate ditutup kembali. Microplate ditempatkan pada ELISA reader dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Pencucian kedua dilakukan dengan wash buffer dengan volume 300 l tiap sumuran sebanyak 4x dan dikeringkan. Sebanyak 100 l substrat larutan berisi TMB ditambahkan ke dalam semua sumuran termasuk ke dalam sumuran larutan standar bovine IgG dan blanko. Microplate diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit, akan terbentuk warna biru. Semua sumuran ditambahkan 100 l stop solution, akan terjadi perubahan warna menjadi kuning. Microplate ditempatkan dan dilakukan pembacaan pada ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm dalam rentang waktu 15 menit. Berdasarkan densitas optik yang diperoleh, dibuat kurva baku dari rata rata densitas optik masing–masing pengukuran pada semua sumuran. Analisis hasil dilakukan dengan program SkanIt Software dari Multiskan GO, Thermo scientific, kemudian dianalisis secara statistik melalui spreadsheet Excel.

3.3.2 PENETAPAN KADAR OPTIMUM IgG DALAM SAMPEL SUSU BUBUK SKIM