yang diperkaya dengan IgG sudah dipasarkan sejak tahun 1998 dengan bahan aktif yang disebut ekstrak kolostrum Mattila 2005.
2.3 ENZYME LINK IMMUNOSORBENT ASSAY ELISA
Imunologi merupakan ilmu yang relatif baru dikembangkan pada masa sekarang, dan immnuoassay adalah salah satu dari pengembangan
metode dari cabang ilmu ini. Perkembangan immunoassay semakin luas dan digunakan untuk metode standar pada analisis pangan karena spesifisitas,
sensitivitas dan simplisitasnya. Immunoassay juga digunakan untuk menganalisa residu dalam pangan, identifikasi bakteri dan virus, serta deteksi
protein Sporns 2004. Ada beberapa jenis immunoassay diantaranya Radial Immunodifusion
RID, Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA, Nephelometry, Turbidometry,
dan Rocket Electro-Phoresis RIEP. Enzyme Link Immunosorbent Assay
, disingkat ELISA, telah berkembang sampai pada tingkatan untuk kemampuan kinerja dengan berbagai konfigurasi Burgess
1995. Beberapa Kit untuk immuno Assays secara komersial sudah tersedia RID and ELISA. Metode ELISA telah banyak mengalami perubahan sejak
teknik ini pertama kali dipublikasikan, ciri utamanya adalah menggunakan indikator enzim untuk reaksi imunologi.
Banyak pilihan untuk konfigurasi metode ELISA sehingga peneliti dapat menggunakan konfigurasi uji yang identik penampilan atau kinerjanya.
Bila ingin menggunakan teknik ELISA dapat memulainya dengan konfigurasi yang relatif sederhana dan menggunakannya untuk menjajagi pilihan yang
lain. Konfigurasi sederhana ini dapat digunakan untuk membakukan serangkaian reagen yang kemudian dapat digunakan untuk mengembangkan
teknik tersebut lebih lanjut.
Konfigurasi yang paling sederhana adalah ELISA langsung Gambar 2 , antigen secara langsung diadsorbsikan ke suatu substrat padat. Permukaan
substrat dicuci dengan antibodi yang ditempeli enzim digunakan untuk
menunjukkan adanya antigen dan hasilnya akan terlihat bila ditambahkan substra dan antiserum harus dikonjugasikan pada enzim. Keterbatasan
konfigurasi ini berkaitan dengan sifat pengikatan substrat padat dan kualitas antibodi indikator. Teknik ini kurang fleksibel, dan konfigurasi ini biasanya
digunakan pada uji untuk mengenali suatu antigen.
Gambar 2. ELISA langsung Burgess 1995
Konfigurasi kedua adalah ELISA tidak langsung, umumnya digunakan untuk mengukur antibodi Gambar 3. Antigen teradsorbsi pada
substrat padat, antibodi primer tidak berlabel dan dapat diperoleh dari serum atau cairan tubuh lain. Antibodi sekunder terikat pada enzim yang sesuai dan
antibodi ini biasanya disebut konjugat serta hasil akan terlihat bila ditambahkan substrat. Antigen dan antibodi sekunder biasanya dibuat konstan
dan yang berubah adalah antibodi primer. Kelemahan utama konfigurasi ini terletak pada tidak adanya spesifisitas karena sebagai akibat bereaksi dengan
antigen yang tidak murni. Ketidakmurnian disebabkan sampel kemungkinan masih mengandung antigen dalam jumlah yang sangat kecil atau dari
antiserum yang ditambahkan sehingga reaksi tidak spesifik.
Gambar 3. ELISA tidak langsung Burgess 1995
Konfigurasi ketiga adalah ELISA penangkap antigen atau Sandwich ELISA, dimana pada konfigurasi ini menggunakan antibodi yang terikat pada
fase padat untuk menangkap antigen secara spesifik Gambar 4. Antibodi penangkap, antigen dan sistem indikator dibuat konstan dan yang berubah
adalah titer antibodi primer untuk antigen spesifik. Bila digunakan antibodi dari berbagai spesies, maka hanya reaksi spesifik yang diinginkan saja yang
diamati, karenanya jika mungkin perlu dipilih antibodi yang dimurnikan berdasar afinitas. Sebagai alternatif adsorbsi berdasar afinitas adalah
menambahkan imunoglobulin knde dalam pengencer.
Gambar 4. Sandwich ELISA Burgess 1995
ELISA penangkap antigen mempunyai potensi untuk meningkatkan spesifitas ELISA tidak langsung asalkan antibodi penangkapnya dapat
menghindarkan penempelan antigen yang ada dalam jumlah kecil yang dapat mengganggu spesifitas tidak langsung. Penggunaan antibodi monoklonal
digabung dengan antigen murni atau antigen yang sudah dimodifikasi dapat memperbaiki spesifitas.
Konfigurasi yang keempat adalah ELISA penangkap antibodi, konfigurasi ini menggunakan antiglobulin yang terikat pada substrat padat.
Antibodi sampel yang diuji ditangkap dan sistem indikator menempel antigen berlabel. Konfigurasi ini yang paling umum digunakan pada uji yang spesifik
terhadap isotipe, misalnya anti-M, diikatkan pada substrat padat Patterson 1998. Antigen berlabel enzim kemudian ditambahkan, baik yang dilabel
secara langsung maupun dilabel lewat ikatan tidak langsung seperti antibodi monoklonal atau biotinstreptavidin dan densitas optik berkaitan dengan kadar
IgM spesifik sampel uji. Konfigurasi kelima adalah ELISA kompetitif atau ELISA pemblok,
teknik ini dapat digunakan dalam sejumlah konfigurasi dasar, kompetisi dapat terhadap antigen atau terhadap antibodi. Pengujian pada kompetisi antibodi
membutuhkan antigen untuk ditangkap antibodi secara langsung maupun lewat antibodi spesifik ke substrat padat. Antibodi yang telah dikenal
berkompetisi dengan antibodi yang tidak dikenal untuk mendapatkan tempat penempelan pada antigen. Antibodi yang telah diketahui dapat dilabel atau
dapat dideteksi menggunakan antibodi antispesiesnya. Perlu diketahui bahwa untuk konfigurasi ELISA kompetitif harus dibatasi hanya untuk penambahan
dua antibodinya dilakukan secara bersamaan. Umumnya konfigurasi ini digunakan untuk mengukur hapten.
Prinsip uji dari ELISA berdasarkan pada ikatan spesifik antigen pada antibodi Ab primer dengan antibodi sekunder anti-species Ig yang dilabel
enzim, kemudian target akan diuraikan oleh enzim yang terdapat di dalam
substrat untuk selanjutnya hasil urai reaksi enzim lebih lanjut akan bereaksi dengan chromogen dan terbentuk warna yang dapat dikuantitasi dan
proporsional dengan jumlah antibodi yang ada dalam sampel. Pembacaan densitas optik OD dari warna yang terbentuk selanjutnya diukur. Tahapan
prosedur uji sandwich ELISA seperti tercantum pada Gambar 5.
Gambar 5. Tahapan prosedur Sandwich ELISA Pomeranz 2000
Setiap konfigurasi harus diperhatikan, terutama variasi yang ada meliputi substrat padat, antigen, penyangga pelapis, cara pelapisan, jenis
antibodi, pengencer, substrat, cara pembacaan hasil dan interpretasi hasil. Setiap konfigurasi harus diperhatikan, terutama variasi yang ada
meliputi substrat padat, antigen, penyangga pelapis, cara pelapisan, jenis antibodi, pengencer, substrat, cara pembacaan hasil dan interpretasi hasil.
Konfigurasi ELISA yang paling umum menggunakan substrat, pada
mulanya enggunakan permukaan gelas Burgess,1995 yang dimaksudkan untuk meningkatkan adsorbsi baik untuk antigen maupun antibodi,
sekarang plastik telah hampir secara universal diterima sebagai pilihan untuk substrat padat. Diperkirakan proses yang dilakukan adalah dengan
maksud untuk pengikatan gugus hidrofobik dan pencucian dengan larutan deterjen menjamin pengikatan lebih lanjut.
Kriteria dalam memilih substrat padat tidak hanya berdasar pada jumlah antigen atau antibodi yang akan mengadsorbsi. Banyaknya
adsorbsi harus dapat diulangi dalam microplate, jumah protein yang teradsorbsi pada tiap sumuran harus pada batas tertentu. Apabila
merancang suatu pengujian maka sebaiknya pada stadium awal dirancang pemilihan substrat padat yang sesuai Burgess 1995. Pilihan meliputi
membran, plate, tabung, tabung kapiler, batang atau manik manik. Polimer harus merupakan suatu bahan yang akan mengadsorsi sampel yang
dikehendaki dalam jumlah banyak namun dengan variasi minimal dari pengujian ke pengujian. Polimer yang digunakan bisa bermacam macam
namun dasar pemilihan harus ditentukan sesuai dengan tujuan pengujian. Antigen atau antibodi dapat secara pasif teradsorbsi pada
permukaan padat dan keragaman dapat terjadi karena perbedaan pH, kekuatan ion dan komposisi penyangga. Variasi dapat berupa terjadinya
pengeringan penyangga pelapis sehingga pelapisan antigen pada plastik tidak terjadi. Selain itu perbedaan suhu akan berpengaruh pada pengikatan
antigen, misalnya pada suhu tinggi pengikatan antigen dapat menyebabkan pengaruh pinggir pada microplate.
Sebagian besar larutan pencuci mengandung deterjen yang digunakan untuk mengurangi reaksi pengikatan non-spesifik. Deterjen
dalam penyangga pelapis dapat menaikkan atau menurunkan pelapisan komponen spesifik. Pemilihan penyangga juga harus diperhatikan karena
mempunyai pengaruh yang besar terhadap hasil pengujian, perlu dicari pengaruh berbagai penyangga dan pemblok. Keragaman terbesar dalam
merancang ELISA dapat dilihat dalam pemilihan konjugat dan substratnya.
Berbagai enzim telah tersedia, enzim secara langsung ke antibodi atau antigen atau secara tak langsung melalui jembatan protein A.
Umumnya tiap enzim memerlukan sejumlah substrat, sehingga keuntungan dapat diperoleh dengan membuat kombinasi enzim dan
substrat tertentu sehingga diperoleh cara yang optimal. Saat ini sudah dapat diperoleh antiserum komersial dengan kualitas yang baik dan titer
tinggi untuk mengikat enzim, sehingga sensitifitas dan spesifisitas makin baik. Umumnya enzim yang digunakan adalah Horseradish peroxydase
HRP, alkaline phosphatase AP dan beta galactosidase. Setiap enzim mempunyai fitur yang unik sesuai dengan kondisi dimana enzim tersebut
dapat digunakan secara optimum. Menurut Burgess 1995 enzim HRP terlihat lebih sensitif pada
immunoassay bila dibandingkan dengan enzim AP. Hal ini terjadi karena
daya katalitik enzim HRP lebih cepat, maka lebih banyak produk yang digenerasi dalam waktu inkubasi yang lebih pendek. Sebagai tambahan,
hidrogen peroksida, suatu ko-substrat pada suatu reaksi, yang dapat menghasilkan suatu inkubasi linier yang lebih cepat. Sensitivitas dapat
ditingkatkan dengan membuat masa inkubasi lebih lama. Faktor lain yang mempengaruhi pemilihan konjugat adalah adanya aktifitas enzim endogen
didalam sampel yang akan mempengaruhi pengujian dan background signal
. Pada kit ELISA yang digunakan untuk analisis, sumur dalam
microplate telah dilapisi dengan poliklonal antibodi bovine IgG dan
antibodi tersebut berikatan secara menyeluruh dengan semua subklas dari bovine IgG
. Bovine IgG kemudian bereaksi dengan detektor antibodi yang terkonjugasi oleh horseradish peroxydase conjugated goat anti-bovine IgG
peroxydase , dan substrat berisi Tetramethyl Benzidine TMB.
Berbagai piranti dengan tingkat kecanggihan yang makin meningkat telah tersedia untuk pembacaan hasil dengan objektif. Perbedaan yang
paling jelas dapat diperoleh dengan memilih panjang gelombang yang tepat. Meneliti profil absorbsi substrat yang digunakan merupakan hal yang
penting, bila memungkinkan dipilih dua panjang gelombang karena hal ini akan variasi antar sumuran. Panjang gelombang primer harus bertepatan
dengan absorbansi puncak sampel. Panjang gelombang sekunder bertepatan dengan dataran yang landai. Hal ini merupakan hal yang penting karena
dapat menyebabkan pengamatan yang tidak peka dan tidak spesifik. Disamping itu akurasi dan efisiensi ELISA ditentukan oleh spesifisitas dan
kemurnian IgG. Umumnya kisaran kerja sistem ELISA untuk mendeteksi
imunoglobulin membutuhkan serum yang sangat encer 110000 sd 1100.000 untuk serum sebelum dimasukkan ke dalam sumuran yang
dilapisi antibodi penangkap. Ini karena prozona lebar muncul ketika digunakan imunoglobulin dalam jumlah berlebihan pada pengujian
Burgess 1995. Pengenceran tinggi seperti yang sesuai dengan serum tersebut biasanya setara dengan 1-500 ngml. Dengan demikian larutan
baku harus sesuai dengan konsentrasi imunoglobulin, yaitu harus dapat mendeteksi batas maksimum dan minimum yang mampu dideteksi oleh
ELISA reader.
Gambar 6. Reaksi pembentukan warna pada proses ELISA
Idealnya harus dibuat kurva baku yang menggambarkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi imunoglobulin menggunakan
satu seri pengenceran serum atau imunoglobulin yang dimurnikan. Jika digunakan serum sebagai standar, biasanya dilakukan prakalibrasi untuk
konsentrasi imunoglobulin yang diselidiki dengan imunoglobulin murni yang diketahui jumlahnya.
Beberapa pengujian hanya menggunakan dua atau tiga pengenceran serum atau imunoglobulin yang dimurnikan untuk
menggambarkan bagian linier kurva hubungan antara absorbansi dan konsentrasi imunoglobulin dalam suatu sampel. Namun kurva baku yang
dibuat berdasarkan satu seri pengenceran memungkinkan penghitungan konsentrasi imunoglobulin dalam sampel yang berada diluar kisaran
liniernya. Perhitungan dapat dilakukan dengan cara manual maupun dengan
program komputer grafik yang menghubungkan absorbansi dengan konsentrasi imunoglobulin
. Format ELISA yang sangat umum digunakan
adalah Sandwich ELISA terutama untuk identifikasi protein.
2.4 VALIDASI METODE ANALISIS
Kategori