17
Alat terlebih dahulu dikalibrasi dengan menggunakan larutan dapar standar netral pH 7,01 dan larutan dapar pH asam pH 4,01 hingga alat menunjukkan harga
pH tersebut. Elektroda selanjutnya dicuci dengan air suling, lalu dikeringkan dengan tissue. Sampel dibuat dalam konsentrasi 1 yaitu ditimbang 0,25 g
sampel dan dilarutkan dalam 25 ml air suling. Elektroda kemudian dicelupkan dalam larutan tersebut. Dibiarkan alat menunjukkan harga pH sampai konstan.
Angka yang ditunjukkan pH meter merupakan pH sediaan.
3.5.5 Penentuan viskositas
Penentuan viskositas dilakukan dengan cara sediaan tinta dimasukkan ke dalam beaker glass 200 ml dan dipilih nomor spindle yang sesuai. Pengukuran ini
dilakukan dengan tiga kali pengulangan menggunakan viskometer Brookfield DV-E.
3.5.6 Penentuanbobot jenis
Penentuan bobot jenis dilakukan dengan menggunakan piknometer. Terlebih dahulu ditimbang berat picnometer kosong, kemudian ditimbang berat
piknometer yang telah berisi tinta. Pengukuran ini dilakukan dengan tiga kali pengulangan. Bobot jenis ditentukan dengan menghitung selisih dari
penimbangan picnometer berisi tinta dengan picnometer kosong. Pengerjaan dilakukan pasa suhu 27
ͦ
C.
3.5.7 Pembuatan larutan pereaksi 3.5.7.1 Larutan pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen, POM., 1979.
3.5.7.2 Larutan pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Ditjen, POM., 1979.
Universitas Sumatera Utara
18
3.5.7.3 Larutan pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling
hingga 100 ml Ditjen, POM., 1979.
3.5.7.4 Larutan pereaksi Mayer
Larutan raksa II klorida P 2,27 bv sebanyak 60 ml dicampur dengan 10 ml larutan kalium iodida P 50 bv, kemudian ditambahkan air secukupnya
hingga 100 ml Ditjen, POM., 1979.
3.5.7.5 Larutan pereaksi Dragendorff
Larutan bismut nitrat P 40 bv dalam asam nitrat P sebanyak 20 ml dicampur dengan 50 ml kalium iodida P 54,4 bv, didiamkan sampai memisah
sempurna, lalu diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Ditjen, POM., 1979.
3.5.7.6 Larutan pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen, POM., 1979.
3.5.7.7 Larutan pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat P dicampur dengan 50 bagian volume etanol 95 P. Tambahkan hati-hati 5 bagian volume asetat anhidrida ke
dalam campuran tersebut, dinginkan Depkes, RI., 1995.
3.5.7.8 Larutan pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh volume 100 ml Ditjen, POM., 1979.
3.5.7.9 Pereaksi asam nitrat 0,5 N
Sebanyak 3,4 ml asam nitrat pekat diencerkan dengan air suling hingga volume 100 ml Ditjen, POM., 1979.
Universitas Sumatera Utara
19
3.5.8 Skrining golongan senyawa kimia
Skrining golongan senyawa kimia meliputi pemeriksaan senyawa gologan alkaloid, flavonoida, glikosida, glikosida antrakinon, saponin, tanin dan
steroidtriterpenoida Farnsworth, 1996.
3.5.8.1 Pemeriksaan alkaloida
Tinta sotong ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit,
didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut :
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan
terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning bila terdapat alkaloida.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat,
akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam bila terdapat alkaloida. c.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendorf, akan terbentuk warna merah atau jingga bila terdapat alkaloida.
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas Depkes, RI., 1995.
3.5.8.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g tinta sotong ditambah 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan saring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan
serbuk magnesium, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok kuat dan dibiarkan memisah. Flavonoida ditunjukkan dengan timbulnya warna merah,
kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.5.8.3 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g tinta sotong dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik.
Universitas Sumatera Utara
20
Saponin dikatakan positif jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N
Depkes, RI., 1995.
3.5.8.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g tinta sotong disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak
2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Tanin dikatakan positif jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman Fansworth, 1966.
3.5.8.5 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g tinta sotong disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 1 jam, didinginkan
dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal asetat 0,4 M, dikocok, diamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran
isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi selanjutnya, diuapkan di
atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch. Tambahkan hati- hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya
cincin ungu pada batas kedua cairan bila adanya gula Depkes, RI., 1995.
3.5.8.6 Pemeriksaan antrakinon
Sebanyak 0,2 g tinta sotong dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, lalu didinginkan, ditambahkan 10 ml benzena, dikocok,
didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Lapisan benzena dikocok dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan
benzena tidak berwarna bila adanya glikosida antrakinon Depkes, RI., 1995.
Universitas Sumatera Utara
21
3.5.8.7 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Sebanyak 1 g tinta sotong dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya
ditambahkan 2 tetes Liebermann-Burchard. Timbulnya warna hijau –biru
menunjukkan adanya steroid dan warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpen Fansworth, 1966.
3.5.9 Pembuatan ekstrak n-heksana tinta sotong Sepia recurvirostra
Tinta sotong Sepia recurvirostra diukur volumenya dengan gelas ukur kemudian dimasukkan dalam wadah beaker glass dan diekstraksi dengan pelarut
n-heksana dengan perbandingan 1:3. Tinta diaduk perlahan-lahan bersama pelarut menggunakan batang pengaduk dan disimpan pada lemari pendingin selama 7
hari. Ekstrak disaring dengan kertas saring Whatmann No.1 dan dipekatkan pada suhu 40
o
C. Ekstrak dikumpulkan dan ditimbang beratnya Girija, 2012. Bagan pembuatan ekstrak n-heksana tinta sotong dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman
36.
3.5.10 Analisis ekstrak n-heksana secara kromatografi lapis tipis
Ekstrak dianalisis secara KLT menggunakan fase diam silika gel 60 F
254
dengan fase gerak campuran n-heksana-etilasetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 dan 50:50. Sebagai penampak bercak digunakan
pereaksi Liebermann –Burchard.
Cara kerja : Ekstrak ditotolkan pada plat lapis tipis, kemudian dimasukkan ke dalam
chamber yang telah jenuh dengan uap fase gerak, setelah pengembangan selesai plat dikeluarkan dan dikeringkan. Plat disemprot dengan penampak bercak dan
Universitas Sumatera Utara
22
dipanaskan dalam oven pada suhu 110 C selama 5 menit lalu diamati perubahan
warna yang terjadi. Bagan perolehan isolat dari ekstrak tinta sotong dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 37 dan hasil analisis ekstrak n-heksana secara KLT
dapat dillihat pada Lampiran 6 halaman 38.
3.5.11 Isolasi senyawa steroidtriterpenoid secara kromatografi lapis tipis preparative
