xxxiv banyak karena lumen ventrikel jantung yang luas dan tekanan aliran darah yang
cukup tinggi. Pengambilan darah dilakukan pada dua ekor kelinci yaitu kelinci A dan kelinci B yang merupakan ulangan pada produksi antibodi anti-Marek dimana
kelinci-kelinci ini telah diinduksi imunogen asal vaksin Marek. Hasil yang diperoleh pada kelinci A sejumlah 35 mL dan kelinci B sejumlah 37 mL. jumlah
tersebut merupakan jumlah optimal pengambilan darah terakhir pada kelinci dengan rataan berat badan sebesar 3.7 Kg.
Gambar 8 Gambar hasil koleksi darah dengan teknik pengambilan intracardial yang ditempatkan pada tissue culture flash dengan tujuan agar
permukaan darah luas sehingga didapatkan serum dengan jumlah yang maksimal.
Darah yang telah diambil dilakukan pemisahan serum dan didapatkan total dari kedua kelinci diperoleh serum sejumlah 28.7 mL serum. Serum tersebut
disimpan pada suhu -20
o
C menunggu untuk dilakukan purifikasi antibodi. Serum merupakan komponen darah yang didalamnya mengandung imunoglobulin yang
merupakan tanggap kebal dari semua perlakuan yang kita berikan. Sebelum dilakukan pemrosesan lebih lanjut, perlu dilakukan pengujian
kesesuaian protein imunoglobulin yang dihasilkan dengan immunogen yang diberikan. Metode yang dilakukan untuk menguji kompatibilitas adalah dengan
Western Blot. Prinsip dari Western Blot adalah manakala antibodi yang dihasilkan memiliki kesesuaian dengan imunogen yang diberikan dengan akan terjadi adanya
ikatan antigen dan antibodi dari serum yang dihasilkan, selanjutnya kromogen akan mengikat komplek antigen-antibodi tersebut. Gambaran hasil Western Blot
Gambar 9 menunjukkan adanya warna yang terbentuk sehingga dapat dipastikan bahwa serum tersebut mengandung antibodi yang mampu mengikat imunogen
yang diinfeksikan.
xxxv Gambar 9 Gambaran Western Blot dari serum row material kelinci yang
digunakan dalam produksi antibodi poliklonal anti-Marek. Warna cokelat yang dihasilkan menunjukkan bahwa ada kesesuaian antara
antibodi yang dihasilkan dengan imunogen yang diberikan, sedangkan warna biru merupakan marker yang digunakan untuk menentukan
berat molekul.
Western Blot merupakan model untuk penerapan ikatan antigen-antibodi yang dilakukan secara in vitro. Metode ini digunakan untuk memastikan adanya
kecocokan antara antibodi yang telah diproduksi dengan imunogen yang diberikan. Tidak ada faktor lain yang menganggu aktivitas ikatan komplek
antigen-antibodi yang terjadi. Warna cokelat yang dihasilkan akibat penggunaan kromogen dengan jenis diaminobenzidine DAB yang merupakan pewarna umum
dalam metode Western Blot.
E. PURIFIKASI ANTIBODI
Pemurnian antibodi dilakukan dengan dua tahap utama, yaitu presipitasi dan Fast Protein Liquid Chromatography FPLC. Tahap presipitasi dilakukan dengan
menggunakan ammonium sulfat yang berfungsi sebagai pengikat IgG. Hasil yang diperoleh dari 28.7 mL serum diperoleh konsentrat IgG dan ammonium sulfat
sejumlah 13.8 mL. Serum sejumlah 2 mL dari hasil presipitasi dilakukan pemurnian dengan FPLC dengan kolom pemisah menggunakan sepharos G,
dimana bahan ini berfungsi spesifik untuk isolasi IgG. Hasil FPLC yang diperoleh dari 2 ml serum post presipitasi didapatkan 159 µL antibodi poliklonal murni.
Perbandingan kemurnian antibodi dengan proses Presipitasi dan FPLC terlihat pada gambar 10. Hasil presipitasi menunjukkan beberapa band angka
berat molekul protein yang dominan sehingga masih dimungkinkan protein lain masih terkandung dalam larutan. Sedangkan hasil FPLC menunjukkan satu band
dominan pada berat molekul 100 kDa. Beberapa band yang muncul akan meningkatkan kemungkinan reaksi silang sehingga menghasilkan positif palsu
yang tinggi. Namun beberapa band yang dominan tersebut memiliki sensitivitas yang lebih tinggi.
xxxvi Gambar 10 Hasil SDS-PAGE antibodi poliklonal anti-MD pasca presipitasi 1,
2, 3 dan pasca FPLC 4, 5, 6. Hasil presipitasi belum menunjukkan berat molekul yang spesifik ditandai dengan banyaknya band yang
terlihat sedangkan hasil purifikasi post FPLC telah menunjukkan 1 band dominan.
Antibodi poliklonal yang diperoleh diaplikasikan untuk imunohistokimia dengan pengenceran 1 : 500 hingga 1000. Setiap potongan jaringan yang diwarnai
dibutuhkan antibodi yang telah diencerkan sebanyak 250 µL. Jadi dari 159 µL antibodi murni tersebut dapat digunakan untuk mewarnai lebih dari 200 potongan
jaringan. Tabel proses produksi antibodi dapat dilihat dari tabel 5.
Tabel 5 Data hasil produksi antibodi poliklonal anti-Marek pada Kelinci New Zealand White.
Hewan Rataan uji
penapisan titer antibodi
Terminal Bleeding
mL Row
Material Serum
mL Presipitasi
mL FPLC
µL
I II
2 ekor Kelinci
A 3.571
4.165 35
14.3 6.7
159 µL 2 mL
B 3.660
4.159 37
14.5 7.1
Total volume 72
28.8 13.8
159 µL
Analogi hasil produksi antibodi yang dilakukan pada kelinci New Zealand White ini menunjukkan bahwa dari 2 mL serum hasil presipitasi menghasilkan
159µL serum murni post FPLC. Apabila 13.8 mL serum hasil presipitasi ini dilakukan pemurnian tahap FPLC maka akan dihasilkan 13.82 x 159 µL =
1097.1 µL. Pengenceran yang digunakan dalam aplikasi antibodi adalah 1:1000 dengan asumsi 1 potongan jaringan memerlukan 250 µL antibodi, sehingga
apabila antibodi ini digunakan dalam metode imunohistokimia akan dapat digunakan sebanyak 1097.1 x 1000 250 = 4388.4 potongan jaringan. Angka ini
cukup ekonomis dibandingkan dengan membeli produk komersial.
F. APLIKASI ANTIBODI POLIKLONAL PADA IMUNOHISTOKIMIA
Sampel yang digunakan adalah jaringan yang telah didiagnosa oleh bagian Patologi -Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, FKH-IPB- sebagai unggas
yang terinfeksi penyakit Marek baik yang derajat infeksi ringan, sedang, hingga berat dengan metode pewarnaan umum Hematoksilin dan Eosin. Sampel yang
digunakan sebanyak 37 jaringan yang berasal dari 37 ekor ayam yang berbeda. Sampel tersebut digunakan sebagai uji keberhasilan produksi antibodi poliklonal
anti-Marek dengan metode imunohistokimia IHK. Tipe prosedur yang
