Landasan Teori TINJAUAN PUSTAKA

2.1.3 Ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi zat aktif dari simplisisa nabati atau simplisia hewani serta menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. 11 2.1.4 Ekstraksi Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya.Pelarut organik yang sangat sering digunakan dalam mengekstraksi zat aktif dari sel tanaman adalah metanol, etanol, kloroform, hexan, aseton, benzen dan etil asetat. Ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu : 11 2.1.4.1 Cara dingin a. Maserasi Maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan cara perendaman menggunakan pelarut dengan sesekali pengadukan pada temperatur kamar. Maserasi yang dilakukan pengadukan secara terus- menerus disebut maserasi kinetic sedangkan yang dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan terhadap maserat pertama dan seterusnya disebut remaserasi. b. Perkolasi 11 Perkolasi adalah proses penyarian simplisia dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Proses perkolasi terdiri dari tahap pelembaman bahan, tahap perendaman antara, tahap perkolasi sebenarnya penetesanpenampungan ekstrak terus-menerus sampai diperoleh perkolat yang jumlahnya 1-5 kali bahan .11 2.1.4.2 Cara panas a. Refluks Refluks adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan alat pada temperatur tititk didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. b. Digesti 11 Digesti adalah proses penyarian dengan pengadukan kontinu pada temperature lebih tinggi daripada temperature ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50°C. c. Sokletasi 11 Sokletasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut yang selalu baru, dilakukan dengan menggunakan alat soklet sehingga menjadi ektaraksi kontinu dengan pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. d. Infludasi 11 Infludasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur 90°C selama 30 menit. e. Dekoktasi 11 Dekoktasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur 90°C selama 30 menit. 11 2.1.5 Radikal bebas 2.1.5.1 Pengertian radikal bebas Radikal bebas adalah atom atau kelompok atom yang mempunyai elektron yang tidak berpasangan di orbital luarnya. 1,2 Radikal bebas ini sangat reaktif karena dapat mencetuskan reaksi yang berantai dengan mengekstraksi sebuah elektron dari molekul disekitarnya untuk melengkapi orbitalnya sendiri. 2 Jika jumlahnya sedikit, radikal bebas dapat dinetralkan oleh sistem enzimatik tubuh, namun jika berlebih, memicu efek patologis. 12 2.1.5.2 Sifat-sifat Radikal Bebas Kerusakan membran sel yang diawali oleh radikal bebas menyebabkan kerusakan sel dengan rangkaian proses sebagai berikut : 1 Terjadi ikatan kovalen antara radikal bebas dengan komponen membran enzim-enzim membran, komponen karbohidrat membran plasma, sehingga terjadi perubahan struktur dan fungsi reseptor. 2 Oksidasi gugus tiol pada komponen membran oleh radikal bebas yang menyebabkan proses transport lintas membran terganggu. 3 Reaksi peroksidasi lipid dan kolesterol membran yang mengandung asam lemak tak jenuh majemuk PUFA = Poly Unsaturated Fatty Acid. Hasil peroksidasi lipid membran oleh radikal bebas berefek langsung terhadap kerusakan membran sel, antara lain dengan mengubah fluiditas, cross-linking, struktur dan fungsi membran serta menyebabkan kematian sel. Dalam keadaan normal tubuh kita mempunyai mekanisme pertahanan terhadap radikal bebas. Kerusakan sel akibat radikal bebas baru dapat terjadi apabila kemampuan mekanisme pertahanan tubuh menurun. 13 2.1.6 Antioksidan Antioksidan adalah senyawa yang bertugas untuk menetralisir peningkatan radikal bebas, melindungi sel dari efek toksik yang dihasilkan serta berkontribusi dalam pencegahan penyakit. 3 Antioksidan dibagi menjadi 2 jenis yaitu antioksidan endogen dan antioksidan eksogen,yang termasuk antioksidan endogen adalah sistem enzim seperti superoxide dismutase SOD, catalase CAT, glutathione peroxidase GPx dan glutathione reductase GRx. Sedangkan yang dimaksud antioksidan eksogen adalah antioksidan yang tidak dapat diproduksi oleh tubuh dan didapat melalui buah-buahan, sayur-sayuran, kacang-kacangan, biji-bijian dan beberapa daging, unggas dan ikan. Makanan-makanan tersebut mengandung vitamin E, Vitamin C, beta karoten dan flavonoid. Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat oksidasi lemak. Oksidasi lemak terdiri dari 3 tahap yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi. 3,4,5 14 Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif akibat dari hilangnya satu atom hidrogen reaksi 1. Pada tahap propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi reaksi 2. Radikal peroksi lebih lanjut akan menyerang asam lemak menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak baru reaksi 3. Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti aldehida dan keton yang berasal dari pemecahan makanan berlemak. Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan mengalami terminasi melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks bukan radikal reaksi 4. Inisiasi : RH  R + H 1 14 Propagasi : R + O 2 ROO + RH  ROOH + R 3  ROO 2 Terminasi : ROO + ROO  non radikal 4 R + ROO  non radikal R + R  non radikal Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi 2 yaitu antioksidan alami dan buatan. a. Antioksidan Alami Antioksidan alami berasal dari tumbuhan yang sering dikonsumsi dan telah diisolasi.Antioksidan yang terdapat dalam tumbuhan mengandung Vitamin C, vitamin E, polienol, karoten, bioflavonoid, katekin dan resveratol. b. Antioksidan Sintetik 15 Antioksidan Sintetik diizinkan penggunaannya dalam makanan untuk menjaga mutu dan dari perubahan sifat kimia makanan akibat proses oksidasi yang terjadi terutama pada waktu penyimpanan. Contohnya BHA Butylated Hidroxyanisol, BHT Butylated Hydroxytoluene, TBHQ Tert-Butyl Hidroxy Quinon, propel galat dan lain-lain. 15 2.1.7 Metode Uji Antioksidan Metode uji antioksidan adalah metode yang digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan yang terkandung dalam suatu sampel. Ada empat metode uji antioksidan yang sering digunakan yaitu : 1. Metode DPPH 15 2. Metode Tiosianat 3. Metode Xanthin Oksidase 4. Metode Deoksiribosa a.Metode DPPH DPPH 1,1-Diphenyl-2-Picrylhidrazyl merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam. DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen sehingga membentuk molekul diagmentik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH, akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH. Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Perubahan ini dapat diukur secara stokiometri sesuai dengan jumlah elektron atau atom hidrogen yang ditangkap oleh molekul DPPH akibat adanya zat antioksidan . Prinsip dari uji antioksidan dengan metode DPPH adalah terjadinya perubahan warna larutan yaitu perubahan warna ungu menjadi ungu pudar dan kuning. Perubahan warna ungu menjadi ungu pudar dan kuning dikarenakan adanya penurunan absorptivitas molar dari molekul DPPH. Perubahan warna tersebut berdasarkan jumlah elektron yang tertangkap. Radikal bebas DPPH yang memiliki elektron tidak berpasangan memberikan warna ungu. Perubahan warna yang terjadi disebabkan adanya ikatan antara elektron DPPH dengan atom hidrogen yang mengindikasikan adanya peningkatan kemampuan antioksidan dalam menangkap radikal bebas. Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning 16,17 terang dan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Dengan demikian, semakin besar konsentrasi larutan, maka semakin memudar warna larutan dan absorbansinya semakin kecil. Menurut metode Blois 17 18 kira-kira ekstrak metanol 4ml pada 0,5 mgml ditambahkan sampai 1 ml DPPH 1 mM dalam larutan metanol di dalam 5 ml botol dengan penutup. Campuran diaduk rata dan disimpan dalam temperatur ruangan selama 10 menit. Lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UVVis. Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan adalah nilai konsentrasi efisien atau efficient concentration EC 19 50 atau Inhibition Contentration IC 50 yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat menyebabkan 50 DPPH kehilangan karakter radikal bebas atau konsentrasi suatu zat antioksidan tinggi akan mempunyai harga EC 50 atau IC 50 yang rendah. Gambar 1.2. Reaksi DPPH dengan Antioksidan Sumber : Prakash 2001 b. Metode Tiosianat Metode ini didasarkan pada kemampuan senyawa antioksidan dalam menghambat terbentuknya radikal yang reaktif. Pembentukan radikal bebas oleh oksidasi asam linoleat. Oksidasi lipid sering disebut autooksidasi karena reaksi tetap berlangsung walaupun tidak ada zat pengoksidasi. Aktivitas antioksidan yang ditemukan dengan metode tiosianat membutuhkan suatu kontrol positif, pembanding ini biasanya merupakan senyawa yang telah diketahui sifat antioksidannya, seperti Vitamin C, butil hidroksi toluena BHT atau tokoferol vitamin E. Oksidasi asam linoleat dalam kondisi buffer yang diinkubasi pada suhu 37 C menggunakan FeCl 2 dan amonium tiosianat sebagai pereaksi oksidator dapat mengoksidasi Fe 2+ menjadi Fe 3+ sehingga menghasilkan warna merah darah yang menyerap sinar tampak pada panjang gelombang 500 nm. 4 c. Metode Xanthine Oxidase Suatu sistem uji evaluasi aktivitas penangkal untuk sampel melawan superoksida anion radikal bebas. 4 Pada metode ini digunakan SOD Superoksida Dismutase.Superoksida dismutase merupakan antioksidan endogen yang dapat mengkatalisis radikal superoksida O 2 menjadi hidrogen peroksida H 2 O 2 , sehingga SOD disebut sebagai scavenger atau pembersih superoksida O 2 . Larutan ekstrak yang akan diuji dicampur dengan SOD dan Xhantine kemudian diukur absorbansinya. 4 d. Metode Deoksiribosa Reaksi degradasi gula deoksiribosa akan menghasilkan suatu produk karbonil dan dikarbonil diantaranya malondialdehid MDA. Adanya MDA dapat dideteksi dengan asam tiobarburat TBA dalam suasana asam membentuk suatu kromogen yang berwarna merah muda. Jumlah kromogen MDA – TBA yang terbentuk sangat tergantung dari jumlah deoksiribosa yang didegradasi. Semakin tinggi konsentrasi deoksiribosa yang ditambahkan akan menyebabkan peningkatan absorbansi kromogen MDA – TBA. 4 2.1.8 Spektrofotometri UV-Vis Spektrofotometri UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur serapan yang dihasilkan dari interaksi kimia antara radiasi elektromagnetik dengan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada daerah UV-Vis. Prinsip dari spektrofotometri UV-Vis adalah mengukur jumlah cahaya yang diabsorbsi atau ditransmisikan oleh molekul-molekul dalam larutan. Ketika panjang gelombang cahaya ditransmisikan melalui larutan, sebagian energi cahaya tersebut akan diserap diabsorpsi. Besarnya kemampuan molekul-molekul zat terlarut untuk mengabsorpsi cahaya pada panjang gelombang tertentu terkenal 19 dengan istilah absorbansi A, yang setara dengan nilai konsentrasi larutan tersebut dan panjang berkas cahaya yang dilalui biasanya 1 cm dalam spektrofotometri ke suatu point dimana persentase jumlah cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi diukur dengan phototube. 19

2.2 Kerangka Konsep

EKSTRAK DAUN SIRSAK Radikal Bebas EksogenEndogen Mempunyai Senyawa Bioaktif Senyawa Flavonoid dan Tanin Berperan Sebagai Antioksidan Contoh: DPPH UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN METODE TIOSIANAT METODE DEOKSIRIBOSA METODE DPPH METODE XHANTINE OKSIDASE Penambahan Larutan DPPH pada ekstrak dgn berbagai konsentrasi diukur absorbansinya Didapatkan Data • Persentase Hambatan • Nilai Probit, • Log Konsentrasi NILAI IC50 Persamaan Linier y=a+bx Radikal bebas menerima elektron dari antioksidan Radikal bebas menjadi molekul stabil

2.3 Definisi Operasional

Tabel 2.1 Definisi Operasional No Variabel Definisi Cara ukur Alat ukur Skala ukur Hasil ukur 1. Konsentrasi ekstrak daun sirsak konsentrasi larutan uji dalam ppm 1 μgmL V1M1=V2M2 perbandingan μg ekstrak dengan mL etanol 96 - Numerik 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm 2. Absorbansi sampel Nilai absorbansi sampel pada masing- masing konsentrasi Diukur pada panjang gelombang maksimum Spektrof otometer Numerik Absorbansi 3. IC50 Nilai yg menunjukan konsentrasi ekstrak ppm yg mampu menghambat proses oksidasi sebesar 50. Persamaan regresi linier dengan analisa Probit. - Kategorik 50 ppm = sgt kuat 50-100 ppm = kuat 100-150 = sedang 151-200 ppm = lemah

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian observasional melalui metode DPPH untuk menguji aktivitas antioksidan dari ekstrak daun sirsak.

3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2012 sampai bulan Agustus 2012 di Laboratorium Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.3 Sampel

Daun sirsak Annona muricata L. yang sudah dideterminasi di LIPI Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia kemudian diekstraksi dan dibuat larutan ekstraknya dengan 4 konsentrasi yaitu 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm, dan 1000 ppm. Masing-masing konsentrasi dibuat secara triplo. 20

3.4 Alat Dan Bahan Penelitian

3.4.1 Alat Penelitian Timbangan analitik; tabung reaksi; tabung erlenmeyer; cawan; gelas ukur; gelas beaker; mikropipet 10, 100, dan 1000 μl; tip 10, 100, 1000 μl; shaker waterbath; kupet dan spektrofotometri UV-Vis HITACHI 2,2 solution 3.4.2 Bahan Penelitian Simplisia; Etanol 96; DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1 g; Asam Askorbat Vitamin C dan Aquadest

3.5 Cara Kerja Penelitian

3.5.1 Penyiapan SampelPembuatan simplisia nabati Daun sirsak Annona muricata L. yang dipetik di kebun LIPI dicuci bersih kemudian dijemur dibawah sinar matahari langsung. Daun yang telah kering diblender hingga menjadi serbuk daun sirsak. 11,21 3.5.2 Pembuatan ekstrak daun sirsak Pembuatan ekstrak daun sirsak Annona muricata L. menggunakan metode maserasi yaitu menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan pengadukan pada temperatur ruangan. 11 3.5.3 Pembuatan Larutan a. Pembuatan Larutan DPPH 0,004 0,004 g100 mL atau 0,0004 g10 mL. DPPH yang ditimbang sebanyak 0,0004 g dilarutkan dalam 10 mL etanol 96. 20 Larutan dikocok hingga homogen dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis untuk memperoleh panjang gelombang maksimum. Panjang gelombang maksimum untuk larutan DPPH adalah 517 nm. 20 b. Pembuatan Larutan Blanko 4500 μL etanol ditambah 500 μL larutan DPPH lalu dikocok hingga homogen. c. Pembuatan Larutan Uji 1. Larutan Induk 10.000 ppm 50 mg ekstrak dilarutkan dalam 5 mL etanol = 10 mgmL = 10.000 μgml ppm 2. Larutan Seri 1, 10,100,1000 ppm. a 1000 ppm 20 500 μL dari larutan induk ditambahkan etanol sampai volumenya 4500 μL. Tambahkan 500 μL larutan DPPH. b 100 ppm