2. Reaksi Biuret dilakukan dengan cara : larutan protein dibuat alkalis dengan
NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO
4
encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada
bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet Sudarmadji dan Suhardi,
1989.
2.4.2 Analisa Kuantitatif
1. Titrasi Formol
Larutan protein dinetralkan dengan NaOH, kemudian ditambahkan formalin dan akan membentuk dimenthiol. Dengan terbentuknya dimenthiol ini
berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam gugus karboksil dengan basa NaOH sehingga titrasi dapat diakhiri dengan
tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein, akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah mudah yang tidak hilang dalam 30 menit. Titrasi
formol ini hanya tepat untuk penentuan protein Sudarmadji dan Suhardi, 1989. 2.
MetodeKjeldahl Metode Kjeldahl dikembangkan pada tahun 1883 oleh pembuat bir
bernama Johann Kjeldahl. Metode Kjeldahl merupakan metode sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang
mengandung nitrogen. Metode kjeldahl cocok untuk menetapkan kadar protein yang tidak larut atau protein yang mengalami koagulasi akibat proses pemanasan
maupun proses pengolahan lain yang biasa dilakukan pada makanan. Metode ini digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara
Universitas Sumatera Utara
tidak langsung karena senyawa yang dianalisisnya adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan faktor konversi 6,25 diperoleh
nilai protein dalam bahan makanan tersebut Sudarmadji dan Suhardi, 1989. Penetapan kadar protein dengan metode ini memiliki kelemahan karena
adanya senyawa lain yang bukan protein yang mengandung nitrogen akan tertentukan sehingga kadar protein yang diperoleh langsung dengan metode
Kjeldahl ini disebut dengan kadar protein kasar crude protein Sudarmadji dan Suhardi, 1989.
Metode kjeldahl dilakukan dengan beberapa tahapan kerja yaitu : a.
Tahap Destruksi Pada tahap ini sampel dipanaskan dengan asam sulfat pekat sehingga
terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya, dimana seluruh N organik dirubah menjadi N anorganik yaitu elemen karbon C teroksidasi menjadi karbondioksida
CO
2
, elemen hidrogen H teroksidasi menjadi air H
2
O, dan elemen nitrogen N berubah menjadi ammonium sulfat {NH
4 2
SO
4
}. Asam sulfat yang dipergunakan untuk destruksi harus dalam jumlah yang cukup dan diperhitungkan
untuk dapat menguraikan bahan protein, lemak, karbohidrat di dalam sampel Bintang, 2010.
Untuk mempercepat proses destruksi ditambahkan katalisator. Gunning menganjurkan menggunakan kalium sulfat K
2
SO
4
dan tembaga II sulfat CuSO
4
. Dengan penambahan katalisator ini, maka titik didih asam sulfat akan ditinggikan sehingga proses destruksi akan berjalan dengan cepat. Tiap 1 gram
kalium sulfat akan mampu meningkatkan titik didih asam sulfat 3
o
C. Suhu
Universitas Sumatera Utara
destruksi berkisar antara 370
o
C-410
o
C. Proses destruksi diakhiri jika larutan telah berwarna hijau jernih Bintang, 2010.
Reaksi yang terjadi pada proses destruksi adalah: Protein + H
2
SO
4p
+ katalisator NH
4 2
SO
4
+ CO
2
+ SO
2
+ H
2
O b.
Tahap Destilasi Pada tahap ini ammonium sulfat {NH
4 2
SO
4
} yang terbentuk pada tahap destruksi dipecah menjadi amonia NH
3
dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Amonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh
larutan baku asam. Larutan baku asam yang dipakai adalah H
3
BO
3
asam borat. Agar kontak antara asam dan amonia berjalan sempurna, maka ujung selang
pengalir destilat harus tercelup kedalam larutan asam. Destilasi diakhiri apabila semua amonia terdestilasi sempurna yang ditandai dengan destilat tidak bereaksi
basis Yazid dan Nursanti, 2006. Reaksi yang terjadi pada tahap destilasi adalah:
NH
4 2
SO
4
+ 2 NaOH NH
3
+ 2 H
2
O + Na
2
SO
4
c. Tahap titrasi
Penampung destilat yang digunakan adalah asam borat berlebih, maka sisa asam borat yang tidak bereaksi dengan amonia dititrasi dengan HCl 0,01 N
menggunakan indikator campuran. Titik akhir titrasi dapat ditandai dengan perubahan warna dari warna ungu menjadi hijau Sudarmadji dan Suhardi, 1989.
Reaksi yang terjadi pada tahap titrasi adalah: 3NH
3
+ H
3
BO
3
NH
4 3
BO
3
NH
4 3
BO
3
+ 3 HCl 3NH
4
Cl + H
3
BO
3
Universitas Sumatera Utara
Kadar protein P dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut: P=
������ ������ −������ ����� ������ �� 1000
x N NaOH x 14,007 x FK x 100 FK= faktor konversi atau perkalian = 6,25
Besarnya faktor konversi nitrogen tergantung pada persentase nitrogen yang menyusun protein dalam bahan pangan yang dianalisa tersebut Budianto,
2009. Besarnya faktor konversi dari bermacam-macam bahan makanan dapat dilihat pada Tabel berikut ini :
Tabel 4. Faktor konversi dari bermacam-macam bahan makanan
No Bahan Makanan
Faktor Konversi 1.
Beras semua jenis 5,95
2. Gandum biji
5,83 3.
Kacang kedelai 5,71
4. Kacang tanah
5,46 5.
Kelapa 5,30
6. Makanan lain umum
6,25 7.
Susu semua jeniskeju 6,38
8. Tepung
5,70
3. Metode Lowry
Konsentrasi protein diukur berdasarkan optikal density pada panjang gelombang 600 nm. Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, lebih
dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi. Larutan Lowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari
fosfotungstat:fosfomolibdat 1:1 dan larutan B yang terdiri dari Na
2
CO
3
2 dlam NaOH 0,1 N, CuSO
4
dan Na-K-tartrat 2. Cara penentuannya adalah 1 ml larutan protein ditambah 0,5 ml Lowry A dikocok dan dibiarkan 20 menit,
selanjutnya diamati absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm Sudarmadji dan Suhardi, 1989.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODE PERCOBAAN
3.1 Tempat Pengujian
