15
2.6 Metode Analisis Vitamin B
2
Riboflavin 2.6.1 Metode Spektrofotometri
Larutan riboflavin dalam dapar pH 4,0 menunjukkan absorbansi maksimum λ maks pada 444 nm dengan �
1 ��
1
320. Cara ini digunakan untuk menetapkan kemurnian riboflavin atau untuk penetapan riboflavin dengan kadar
lebih besar dari 90. Penetapan riboflavin dilakukan dengan cara terlindung dari cahaya Rohman, 2008.
Cara penetapan riboflavin tunggal secara spektrofotometri: lebih kurang 100 mg riboflavin yang ditimbang saksama dilarutkan dengan pemanasan dalam
campuran 2 mL asam asetat glasial dan 150 mL air. Larutan selanjutnya diencerkan dengan air, didinginkan, ditambah air secukupnya hingga 1000 mL.
Pada 10,0 mL larutan ditambah 3,5 mL natrium asetat 0,1 M kemudian ditambah air secukupnya hingga 100 mL. Larutan akhir diukur absorbansinya dengan kuvet
1 cm pada panjang gelombang 444 nm. Kadar riboflavin dihitung dengan menggunakan riboflavin baku sebagai pembanding Rohman, 2008.
2.7 Spektrofotometer
2.7.1 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum
dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi, spektrofotometer
digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut
16 ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi panjang gelombang
Khopkar, 2008. Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum
ultraviolet dan sinar tampak terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang 200-800
nm Rohman, 2007. Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan
intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorpsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan
elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV- Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam
larutan. Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini. Tetapi
spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan sinar tampak berada pada
panjang gelombang 400-800 nm Dachriyanus, 2004.
2.7.2 Instrumentasi Spektrofotometer UV-Vis
Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut ”spektrometer”
atau spektrofotometer. Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi: 1 sumber tenaga radiasi yang stabil, 2 sistem yang terdiri atas lensa-
17 lensa, cermin, celah-celah, dan lain-lain, 3 monokromator untuk mengubah
radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal, 4 tempat cuplikan yang transparan, dan 5 detektor radiasi yang dihubungkan dengan
sistem meter atau pencatat Sastrohamidjojo, 1991. Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi:
a. Sumber tenaga radiasi
Sumber radiasi ultraviolet. Sumber-sumber radiasi ultraviolet yang kebanyakan digunakan adalah lampu hidrogen dan lampu deuterium. Mereka
terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan yang rendah. Bila tegangan
yang tinggi dikenakan pada elektroda-elektroda, maka akan dihasilkan elektron- elektron yang mengeksitasikan elektron-elektron lain dalam molekul gas ke
tingkatan tenaga yang tinggi. Bila elektron-elektron kembali ke tingkat dasar mereka melepaskan radiasi yang kontinyu dalam daerah sekitar 180 dan 350 nm.
Sumber radiasi ultraviolet yang lain adalah lampu xenon, tetapi ia tidak se stabil lampu hidrogen Sastrohamidjojo, 1991.
b. Monokromator
Seperti kita ketahui bahwa sumber radiasi yang umum digunakan menghasilkan radiasi kontinu dalam kisaran panjang gelombang yang lebar.
Dalam spektrometer, radiasi yang polikromatik ini harus diubah menjadi radiasi monokromatik. Ada dua jenis alat yang digunakan untuk mengurai radiasi
polikromatik menjadi monokromatik yaitu penyaring dan monokromator. Penyaring dibuat dari benda khusus yang hanya meneruskan radiasi pada daerah
18 panjang gelombang tertentu dan menyerap radiasi dari panjang gelombang yang
lain. Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektifpanjang gelombang-gelombang
tunggalnya dan memisahkan panjang gelombang-gelombang tersebut menjadi jalur-jalur yang sangat sempit Sastrohamidjojo, 1991.
c. Tempat cuplikan
Cuplikan yang akan dipelajari pada daerah ultraviolet atau terlihat yang biasanya berupa gas atau larutan ditempatkan dalam sel atau cuvet. Untuk daerah
ultraviolet biasanya digunakan Quartz atau sel dari silika yang dilebur, sedangkan untuk daerah terlihat digunakan gelas biasa atau quartz Sastrohamidjojo, 1991.
d. Detektor
Setiap detektor menyerap tenaga foton yang mengenainya dan mengubah tenaga tersebut untuk dapat diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik
atau perubahan-perubahan panas. Kebanyakan detektor menghasilkan sinyal listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat. Setiap pencatat harus
menghasilkan sinyal yang secara kuantitatif berkaitan dengan tenaga cahaya yang mengenainya. Persyaratan-persyaratan penting detektor meliputi: 1 sensitivitas
tinggi hingga dapat mendeteksi tenaga cahaya yang mempunyai tingkatan rendah sekalipun, 2 waktu respon yang pendek, 3 stabilitas yang panjanglama untuk
menjamin respon secara kuantitatif, dan 4 sinyal elektronik yang mudah diperjelas Sastrohamidjojo, 1991.
19
BAB III METODOLOGI
3.1 Tempat
Kategori