b. Pembuatan larutan stok rutin. Sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan
dalam metanol p.a hingga 10,0 mL. c.
Pembuatan larutan pembanding. Diambil 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0 mL larutan stok rutin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga
diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 15; 17,5; 20; 22,5; 25 μgmL. d.
Pembuatan larutan uji. Sebanyak 20 mg ekstrak ditimbang, kemudian ditambahkan metanol p.a. sampai 20,0 mL. Dari larutan itu kemudian
diambil 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0 mL untuk kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol.
5. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik. Sejumlah 0,5 mL larutan uji ditambahkan 5 mL
pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang sudah diencerkan dengan akuades 1:10; vv ke dalam tabung reaksi. Larutan tersebut ditambahkan dengan 4,0 mL natrium
karbonat 1M. Selanjutnya, diamati warna pada larutan tersebut. Terbentuknya
warna biru menunjukkan adanya polifenol. b.
Uji pendahuluan aktivitas antioksidan. Disiapkan metanol p.a
,larutan DPPH 0,4 mM, larutan pembanding ru tin 20 μgmL, dan larutan induk
sampel 1000 μgmL. Larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing 3
tabung reaksi. Selanjutnya, ditambahkan metanol p.a tabung I, larutan uji tabung II, dan larutan pembanding rutin tabung III, dengan perbandingan
masing-masing 1:1. Diamati perubahan warna pada masing-masing tabung.
6. Penentuan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat. Sejumlah 0,5 mL larutan asam
galat 50, 75, 100, 125 dan 150 μgmL ditambahkan dengan 5,0 mL larutan reagen Folin-Ciocalteu yang sudah diencerkan dengan menggunakan aquadest 1:10.
Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL larutan Na
2
CO
3
1M. Sesudah 30 menit, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 760 nm.
b. Optimasi penetapan kandungan fenolik total.
1 Penentuan Operating Time OT
Diambil 0,5 mL larutan induk asam galat 50, 100 dan 150 μgmL, lalu ditambahkan dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang sudah diencerkan
dengan aquadest 1:10. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL larutan Na
2
CO
3
1M. Absorbansi diukur tiap 5 menit selama 40 menit pada panjang gelombang 760 nm.
2 Penentuan panjang gelombang maksimum
Sejumlah 0,5 mL larutan asam galat 50, 100 dan 150 μgmL
ditambahkan dengan 5,0 mL larutan reagen Folin-Ciocalteu yang sudah diencerkan dengan aquadest 1:10, lalu ditambahkan dengan 4,0 mL larutan
Na
2
CO
3
1M. Dilakukan scanning pada panjang gelombang 600 – 800 nm.
c. Estimasi penetapan kadar senyawa fenolik total sampel. Diambil
0,5 mL larutan uji 500 μgmL, lalu ditambahkan dengan 5,0 mL larutan reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquadest 1:10, dan dilanjutkan
dengan penambahan 4,0 mL larutan Na
2
CO
3
1M. Sesudah 30 menit, dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 748,6 nm. Kandungan fenolik
total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.
7. Optimasi metode uji antioksidan
