3.4 Pembuatan Ekstrak Etanol Umbi Keladi Tikus
Sebanyak 500 gram serbuk simplisia dimasukkan kedalam bejana tertutup, etanol 96 dituangkan ke dalam bejana sampai seluruh simplisia terendam, aduk,
biarkan sekurang-kurangnya selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit kedalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, tuangi cairan penyari
secukupnya sampai cairan mulai menetes dan diatas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator, biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan
menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, tambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia.
Perkolasi dihentikan setelah tetesan terakhir perkolat tidak berwarna lagi atau apabila sebanyak 500 mg cairan perkolat diuapkan di atas penangas air tidak
meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap vakum putar rotary evaporator. Kemudian dikeringkan dengan menggunakan
freeze dryer dan diperoleh ekstrak kental sebanyak 16,71 g. Alur pembuatan ekstrak dapat dilihat pada Lampiran 6, halaman 56.
3.5 Uji Efek Imunomodulator
Uji efek imunomodulator meliputi penyiapan hewan percobaan, penyiapan kontrol, bahan uji, larutan penyangga dan antigen, uji respon hipersensitivitas tipe
lambat, dan uji titer antibodi.
3.5.1 Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan dengan berat 20-35 g dibagi 5 kelompok, 1 kelompok untuk kontrol negatif, 1 kelompok untuk kontrol positif,
dan 3 kelompok uji. Tiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit.
Universitas Sumatera Utara
Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu dalam kandang yang baik pada
suhu ruangan untuk penyesuaian lingkungan, pengontrolan kesehatan dan berat badan. Mencit diberi makan pelet hewan dan minum air keran. Shukla et.al.,
2009.
3.5.2 Penyiapan Kontrol, Bahan Uji, Larutan Penyangga dan Antigen
Penyiapan kontrol, bahan uji, larutan penyangga dan antigen meliputi penyiapan CMC 1, penyiapan suspensi siklofosfamida 0,5, penyiapan
suspensi ekstrak umbi keladi tikus 2, penyiapan larutan penyangga phosphate buffered saline, dan penyiapan sel darah merah domba.
3.5.2.1 Penyiapan CMC 1
Pembuatan suspensi CMC 1 bv dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas
sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air,
kemudian dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.5.2.2 Penyiapan Suspensi Siklofosfamida SS 0,5
Pembuatan suspensi siklofosfamida 0,5 bv dilakukan dengan cara sebagai
berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa
yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 125 mg siklofosafamida ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang
ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
Universitas Sumatera Utara
3.5.2.3 Penyiapan Suspensi Ekstrak Umbi Keladi Tikus SEUKT 2
Pembuatan suspensi ekstrak umbi keladi tikus 2 bv dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi
air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan sebanyak 500
mg ekstrak umbi keladi tikus ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah air suling sampai batas
tanda.
3.5.2.4 Penyiapan Phosphate Buffered Saline PBS
Pembuatan PBS dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 8 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 1,44 gram Na
2
HPO
4,
0,24 gram KH
2
PO
4,
dilarutkan dalam 800 ml aqua bidestilasi, kemudian dicek pH dengan indikator pH hingga pH ±7
dan dapat disesuaikan dengan penambahan HCl atau NaOH, tambahkan aqua bidestilasi hingga 1 L DeAngelis, 2007.
3.5.2.5 Penyiapan Sel Darah Merah Domba SDMD
Penyiapan dan pembuatan SDMD didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Puri, et.al., 1993. Darah segar dikumpulkan dari domba yang disembelih.
Darah dipisahkan dari plasmanya dengan pemusingan 1900 rpm menggunakan alat sentrifugasi pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Kemudian supernatan dibuang. Endapan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali. Setelah pencucian selesai, PBS
dibuang, maka diperoleh SDMD 100. Ke dalam SDMD 100 ditambahkan PBS dengan volume yang sama, hingga diperoleh SDMD 50. Kemudian
diambil 0,2 ml SDMD 50, tambahkan PBS hingga 10 ml, sehingga diperoleh SDMD 1.
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Uji Respon Hipersensitivitas Tipe Lambat
Efek imunomodulator ekstrak umbi keladi tikus ditentukan dengan mengukur volume respon hipersensitivitas tipe lambat menggunakan uji pembengkakan
telapak kaki hewan uji foot paw swelling test Lakshmi, et.al., 2003;Ray, et.al., 1996.
Sebanyak 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian sebagai berikut:
Kelompok I diberi suspensi CMC Na 1 bv sebagai kontrol negatif Kelompok II diberi Suspensi Ekstrak Umbi Keladi Tikus SEUKT dengan dosis
100 mgkg BB Kelompok III diberi SEUKT dengan dosis 200 mgkg BB
Kelompok IV diberi SEUKT dengan dosis 400 mgkg BB Kelompok V diberi Suspensi Siklofosfamida SS dengan dosis 50 mgkg BB
sebagai kontrol positif Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah domba SDMD
1 dalam PBS secara intraperitoneal pada hari ke-0. Perlakuan dimulai dari hari ke-0 dan diberikan satu kali setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sendi kaki
mencit sebelah kanan diberi tanda batas pengukur an volume kaki mencit. Volume kaki mencit diukur sebagai volume awal V
. Kemudian mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml suspensi SDMD 1 dalam PBS secara intraplantar pada telapak
kaki sebelah kanan. Pada hari kedelapan setelah 24 jam diukur volume pembengkakan kaki
mencit dengan platismometer air raksa. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi air raksa sampai tanda
Universitas Sumatera Utara
batas pengukuran. Perubahan volume air raksa terlihat pada kenaikan skala pada pletismometer sebagai volume waktu tertentu Vt kaki mencit. Volume
pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara volume waktu tertentu Vt dengan volume awal V
. Shivaprasad, et.al., 2006. Gambar pembengkakan kaki mencit dapat dilihat pada Lampiran 9, halaman 61.
3.5.4 Uji Titer Antibodi
Kategori