Alat dan Bahan Tata Cara Penelitian

D. Alat dan Bahan

1. Alat Alat – alat yang digunakan pada penelitian ini, meliputi : Silet pencukur bulu, punch biopsy, pinset, gunting bedah, nampan Lionstar®, kertas penutup, alat- alat gelas, kertas pembungkus, water heater, termometer, sendok, magnetik stirrer, corong buchner, pompa vakum, timbangan analitik, oven, 2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi limbah kulit udang yang didapatkan dari restoran seafood daerah Sleman, Yogyakarta, Aloe vera, HCl 37 p.a, NaOH, aseton p.a, kupro sulfat anhidrat, kalium iodide, iodium, asam sulfat, perak nitrat, aquadest, reagen biuret, Ketamine, Etil klorida, pH stick universal, tikus jantan galur Wistar Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

E. Tata Cara Penelitian

1. Pemilihan bahan Bahan yang dipilih adalah kulit udang dari satu rumah makan di daerah Palagan Tentara Pelajar, Sleman Yogyakarta. Bahan ini diambil dalam kurun waktu seminggu sekali pada bulan Maret. Bahan lain yang digunakan adalah Tanaman lidah buaya atau Aloe vera yang diambil dari kebun tanaman di daerah Sleman Yogyakarta. Waktu panen tanaman lidah buaya ini adalah pada bulan Agustus dengan usia panen 3-4 bulan. 2. Penyiapan bahan Kulit udang yang diambil dari limbah warung maupun restoran seafood, kemudian dicuci dengan air agar kotoran yang melekat hilang, lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 110-120 o C selama kurang lebih satu jam. Setelah kering kemudian dihancurkan menjadi serbuk dengan menggunakan blender dan diayak menggunakan ayakan bernomor 40 sehingga diperoleh serbuk dengan ukuran partikel yang lebih kecil dari ukuran ayakan. Hasil ayakan digunakan sebagai sampel. 3. Ekstraksi kitosan dari kulit udang a. Penghilangan mineral demineralisasi Sebanyak 150 g serbuk kulit udang ditambahkan dengan 2,250 L HCl 1,5 M dengan perbandingan 1:15 bv antara sampel dengan pelarut. Campuran dipanaskan pada suhu 70- 80 o C selama 4 jam sambil dilakukan pengadukan pada 50 rpm kemudian disaring. Padatan yang diperoleh dicuci dengan akuades untuk menghilangkan HCl yang tersisa. Filtrat terakhir yang diperoleh diuji dengan larutan AgNO 3 , bila sudah tidak terbentuk endapan putih maka sisa ion Cl yang terkandung sudah hilang. Selanjutnya padatan dikeringkan pada oven dengan temperatur 70 o C selama 24 jam sehingga diperoleh serbuk kulit udang tanpa mineral yang kemudian didinginkan dalam desikator. Langkah demineralisasi dari kulit udang ini diulang sebanyak dua kali, yang satu digunakan pada tahap optimasi konsentrasi NaOH dan yang satu lagi digunakan pada tahap optimasi suhu pada proses deasetilasi Weska dan Moura, 2006. b. Deproteinase Masing-masing serbuk kulit udang kering dimasukkan ke dalam gelas beaker 1 L dan ditambahkan larutan NaOH 3,5 masing-masing dengan perbandingan 1:10 bv antara sampel dengan pelarut. Campuran tersebut dipanaskan pada suhu 65-70 o C selama 4 jam sambil dilakukan pengadukan pada 50 rpm. Selanjutnya padatan disaring dan didinginkan sehingga diperoleh khitin, yang kemudian dicuci dengan akuades sampai pH netral. Filtrat yang diperoleh diuji dengan pereaksi biuret, bila filtrat berubah menjadi biru berarti protein yang terkandung sudah hilang. Kitin yang sudah dicuci ditambahkan etanol 70 untuk melarutkan kitosan terlarut sebanyak 100 mL dan dilanjutkan dengan penyaringan, pencucian kembali dengan akuades panas dan aseton untuk menghilangkan warna sebanyak dua kali masing- masing 100 mL, lalu dikeringkan pada suhu 80 o C selama 24 jam kemudian didinginkan dalam desikator. Weska dan Moura, 2006. c. Deasetilasi kitin menjadi kitosan Kitin hasil deproteinisasi direndam dalam larutan NaOH dengan konsentrasi NaOH 5 sedangkan suhu dan waktu reaksi dibuat konstan yaitu 120 o C selama 4 jam. 4. Ekstraksi Aloe vera Tanaman lidah buaya yang sudah ditanam selama 3-4 bulan, dipilah dan diambil bagian daunnya. Daun lidah buaya dicuci dan dibersihkan, diangin-anginkan, dipotong kecil-kecil, ditimbang dalam keadaan kering, dan dioven pada suhu 50 o C selama 24 jam. Daun lidah buaya yang telah kering, digiling dan diserbuk. Simplisia kering yang telah didapatkan direndam dengan pelarut etanol dengan perbandingan 1:10 lidah buaya : etanol selama 48 jam, lalu disaring. Ampas dari penyaringan dibuang dan pelarut diuapkan hingga selama 24 jam hingga terbentuk ekstrak kental dari lidah buaya. 5. Pembuatan gel dengan kitosan dari kulit udang dan ekstrak Aloe vera Serbuk kitosan dan ekstrak Aloe vera diformulasikan dengan basis gel carbopol dengan bahan : R Carbopol 0,75 Metil Paraben 0,02 Gliserin 2,0 TEA 2,0 Aquadest ad 100 Formulasi gel dengan variasi Aloe vera dapat dilihat dalam tabel VI. Tabel VI. Formulasi gel Formula Bahan Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4 Formula 5 Carbopol 0,75 g 0,75 g 0,75 g 0,75 g 0,75 g Metil Paraben 0,02 g 0,02 g 0,02 g 0,02 g 0,02 g Gliserin 2 g 2 g 2 g 2 g 2 g TEA 2 g 2 g 2 g 2 g 2 g Kitosan 2 g - 2 g 2 g 2 g Aloe vera - 3 g 1 g 2 g 3 g Aquadest 93,23 g 92,23 g 92,23 g 91,23 g 90, 23 g 6. Sterilisasi produk Sterilisasi produk tidak dilakukan dengan mensterilkan sediaan yang telah jadi, namun dengan cara mensterilkan semua peralatan yang akan digunakan untuk membuat gel. Sterilisasi dilakukan dengan cara mencelupkan semua alat yang akan digunakan kedalam alkohol. 7. Karakterisasi gel kitosan dari kulit udang Gel kitosan yang telah jadi dan dapat digunakan diuji karakterisasinya menggunakan uji pengamatan secara organoleptis, uji viskositas, uji pH, dan uji daya sebar dari gel. Pengamatan secara organoleptis yang dilakukan adalah pengamatan pada gel yang hanya menggunakan mata tanpa alat bantu. Parameter yang dinilai dari uji organoleptis adalah warna, bau, dan aplikasi gel pada kulit. Pengukuran viskositas dilakukan dengan menempatkan sampel dalam viskometer Rion vt 04 f hingga spindel terendam. Jarum spindle atau nomor rotor yang digunakan adalah nomor rotor 2. Rotor yang dipilih adalah rotor nomor 2 dikarenakan besaran viskositas yang diberikan oleh gel adalah berkisar di atas 200 dpas. Viskometer Rion vt 04f dijalankan, kemudian viskositas dari gel dapat dibaca dengan menunggu hasil pembacaan stabil. Pengukuran pH gel dilakukan dengan menggunakan pH universal. Pengamatan dilakukan dengan mengambil gel yang akan diuji sebanyak 1 gram kemudian pH universal dimasukan kedalam gel hingga semua kolom warna pH terbasahi. pH universal yang telah terbasahi dibandingan dengan panduan pH yang tertempel pada kotak pH, dan pH dari gel dapat diketahui. Pengukuran daya sebar dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 1 gram sediaaan gel dan diletakkan dengan hati-hati di atas kaca nulat berdiameter 10 cm. Selanjutnya ditutup dengan kaca transparan dan diberikan pemberat diatasnya dari bobot 0 gram hingga bobot mencapai 200 gram, kemudian diukur diameter yang terbentuk setelah 1 menit. 8. Pengujian gel kitosan dan ekstrak Aloe vera pada tikus Tujuh ekor tikus menjadi kelompok perlakukan gel dengan kitosan dari limbah kulit udang konsentrasi 2 yang merupakan konsentrasi efektif untuk menyembuhkan luka yang didapatkan dari penelitian sebelumnya ditambah dengan penambahan ekstrak Aloe vera dengan variasi konsentrasi 1, 2, dan 3. Kemudian pada tiap-tiap tikus dibuat luka pada bagian punggung yang digunakan dalam pengamatan perlakuan. Dibuat enam luka pada punggung, yaitu kontrol positif bioplacenton®, kontrol negatif Gel kitosan 2, kontrol gel Aloe vera konsentrasi perlakukan tertinggi 3 tanpa kitosan, perlakuan gel kitosan dengan ekstrak Aloe vera dengan tiga konsentrasi berbeda 1, 2, 3 Gambar 6.. Dengan demikian setiap kelompok besar terdapat 7 replikasi perlakuan. Gambar 6. Luka pada setiap tikus : A kontrol positif Bioplacenton®; B kontrol negatif gel kitosan 2; C perlakuan dengan ekstrak Aloe vera konsentrasi tertinggi 3; D perlakuan gel kitosan dengan ekstrak Aloe vera 1; E perlakuan gel kitosan dengan ekstrak Aloe vera 2; F perlakuan gel kitosan dengan ekstrak Aloe vera 3; G kontrol negatif kassa steril 9. Pembuatan luka pada tikus Sebanyak 7 ekor tikus dari kelompok pertama diberi ketamine secara intraperitoneal i.p. dengan dosis yang dapat menimbulkan efek anesthesia pada tikus, yaitu sebesar 0,2 ml250 g BB ketamine. Setelah tikus tertidur, pada bagian bulu bagian belakangnya ini dibersihkan dengan alat cukur steril. Setelah bulunya dibersihkan maka daerah kulit yang akan disayat dibersihkan dengan alcohol 70 secukupnya. Kemudian dibuat luka berbentuk lingkaran atau membulat menggunakan alat punch biopsy steril dengan diameter 6mm pada lapisan kulit tikus sedalam 2mm. Setelah dilakukan prosedur pembuatan luka, tikus dikembalikan pada wadahnya masing-masing Dipietro dan Burn, 2003. 10. Pemberian gel, kontrol positif dan kontrol negatif pada tikus Setelah tikus yang dibuat luka sebanyak 6 luka, luka tikus tersebut dioleskan dengan gel berbagai konsentrasi sebagai perlakuan. Pada tikus juga digunakan beberapa kontrol, yaitu kontrol positif, kontrol negatif, dan kontrol perlakuan dengan menggunakan gel ekstrak Aloe vera saja. Pengolesan luka dengan gel ini dilakukan setiap 24 jam sekali selama 7 hari. 11. Pengamatan kecepatan penyembuhan luka Setelah gel ini diaplikasikan pada luka terbuka kulit tikus selama 7 hari yang diamati setiap harinya, tiap luka tikus ini diamati proses penyembuhan lukanya. Kecepatan penyembuhan luka dilihat secara kualitatif dan kuantitatif makroskopik. Pengamatan kualitatif dilakukan dengan melihat keberadaan keropeng dan warna pada luka serta daerah yang berada disekitarnya. Pengamatan kuantitatif dilakukan dengan menghitung diameter luka, pengurangan diameter Kusmiati, et.al, 2006.

F. Analisis Data