4.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media MHA sebanyak 30 gram dilarutkan ke dalam 1000 ml aquadest, lalu dipanaskan diatas tungku pemanas
magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoclaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121°C. Setelah
disterilkan, media disimpan di dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-
masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
4.7.4 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. P. gingivalis yang digunakan adalah specimenstem cell P. gingivalis ATCC 33277 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang telah
disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan
dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1,5 x 10
8
CFUml.
4.7.5 Penentuan KHM bahan coba
Bahan coba ekstrak kulit buah manggis yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78, 0,39, 0,195, 0,0975,
0,0487 dan 0,02437. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai
konsentrasinya. Selanjutnya diambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-
masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung- tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan bantuan spektrofotometer dan
membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak
jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak yang mampu menghambat pertumbuhan P. gingivalis dalam media
perbenihan setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.
4.7.6 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78, 0,39, 0,195, 0,0975, 0,0487 dan 0,02437 dengan metode
Drop Plate Mills Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing- masing divorteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam
media padat Mueller Hinton Agar, direplikasi 3 petri, didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C
selama 24 jam dan media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM dengan bantuan
kaca pembesar. Jika pada konsentrasi terkecil pertumbuhan bakteri tidak ditemukan steril = 0 CFUml maka konsentrasi tersebut yang menjadi nilai KBM.
Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang
dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian
dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah
koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri
pada media padat sebanyak 50 μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml
Kategori