BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan bahan tumbuhan, pembuatan ekstrak, analisis fraksi n-heksan yang dilanjutkan isolasi
senyawa triterpenoid menggunakan kromatografi kolom dan KLT preparatif. Isolat yang diperoleh diuji kemurniannya dengan KLT satu arah dan dua arah,
karakterisasi isolat dengan spektrofotometer ultraviolet dan inframerah.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, blender National, desikator, hairdryer Fransen, neraca digital
Vibra AJ, neraca kasar Home Line, oven listrik Memmert, penangas air Yenaco, penguap vakum putar Haake D1 Fisons, seperangkat alat KLT dan
alat kromatografi kolom, seperangkat alat penetapan kadar air, spektrofotometer inframerah IRPrestige21 Shimadzu, spektrofotometer ultraviolet UV1800
Shimadzu dan tanur.
3.2 Bahan-bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah umbi bawang sabrang Eleutherinae bulbus. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan
lain adalah berkualitas proanalisis, yaitu asam asetat anhidrid, asam asetat glasial, asam klorida, asam nitrat, asam sulfat, benzen, besi III klorida, bismut III
nitrat, etanol, eter, eter minyak tanah, etilasetat, iodium, isopropanol, kalium
Universitas Sumatera Utara
iodida, kalium natrium tartrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, n-heksan, plat pralapis silika gel GF
254
, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk seng, silika gel GF
254
, silika gel 60 mesh 70-230 ASTM,
timbal II asetat, tembaga sulfat, toluen, dan α- naftol. Air suling dan n-heksan
hasil destilasi.
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah umbi bawang sabrang Eleutherinae bulbus yang diambil dari Jalan Bunga Rampe V, Kelurahan
Simalingkar B, Kecamatan Medan Tuntungan, Kotamadya Medan, Sumatera Utara. Bagian tumbuhan yang digunakan adalah umbi segar yang berwarna merah
dengan umur ± 3 bulan. Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan dari tempat lain.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI, Bogor.
3.3.3 Pembuatan Simplisia
Umbi bawang sabrang Eleutherinae bulbus yang baru diambil dibersihkan dari kotoran, dicuci dengan air yang bersih, ditiriskan di atas kertas
perkamen, lalu ditimbang berat basahnya. Simplisia basah diiris, dikeringkan di lemari pengering hingga kering dan rapuh, lalu ditimbang berat keringnya.
Selanjutnya simplisia kering diserbuk dengan blender dan disimpan dalam wadah yang kering.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi dilakukan menurut Depkes 1979 pereaksi kloralhidrat, asam klorida 2 N, natrium hidoksida 2 N, Bouchardat, Mayer,
Depkes 1995 pereaksi besi III klorida 1, timbal II asetat 0,4 N, Molish, Zweig 1987 pereaksi Dragendorff dan Wagner, et all 1984 pereaksi
Liebermann-Burchard.
3.4.1 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kloralhidrat ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml air suling.
3.4.2 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.
3.4.3 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.
3.4.4 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam 8 ml air suling, lalu ditambahkan 2 g iodium dilarutkan sedikit demi sedikit ke dalam kalium iodida,
lalu volumenya dicukupkan dengan air suling sampai 100 ml. 3.4.5 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,85 g bismuth III nitrat dilarutkan dalam 100 ml asam asetat glasial, lalu ditambahkan 40 ml air suling. Pada wadah yang lain dilarutkan 8 g
kalium iodida dalam 20 ml air suling, kemudian dicampurkan kedua larutan sama banyak, lalu ditambahkan 20 ml asam asetat glasial dan diencerkan dengan air
suling sampai 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.4.6 Pereaksi Mayer
Sebanyak 60 ml raksa II klorida dicampur dengan 10 ml larutan kalium iodida 50, kemudian ditambahkan air suling sampai 100 ml.
3.4.7 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh 100 ml larutan.
3.4.8 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 ml.
3.4.9 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrid ditambahkan 5 ml asam sulfat pekat, ditambahkan ke dalam 50 ml etanol absolut, dibiarkan mendingin. Larutan ini
harus dibuat baru.
3.4.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 N
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida secukupnya hingga 100 ml.
3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia dilakukan menurut World Health Organization 1992 penetapan kadar air dan Depkes 1995 pemeriksaan
makroskopik, pemeriksaan mikroskopik, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan
penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.
Universitas Sumatera Utara
3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik terhadap umbi segar dan simplisia dilakukan dengan mengamati organoleptis, meliputi bentuk, warna, bau dan rasa, serta
ukuran.
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan kloralhidrat, dipanaskan di
atas lampu spiritus, kemudian ditutup dengan kaca penutup, diamati di bawah mikroskop. Untuk melihat adanya butir amilum, serbuk simplisia ditaburkan di
atas kaca objek yang telah ditetesi dengan air suling, kemudian ditutup dengan kaca penutup, diamati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Cara kerja :
Ke dalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam. Setelah itu toluen dibiarkan mendingin selama 30 menit
dan volume air pada tabung penerima dibaca. Kemudian ke dalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan
hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik, sampai sebagian air terdestilasi. Kemudian kecepatan destilasi
dinaikkan hingga 4 tetes per detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian
tabung penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen
Universitas Sumatera Utara
memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang
diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen.
3.5.4 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter
dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai
kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, dan sisa dipanaskan pada suhu 105º C sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung
terhadap bahan yang telah dikeringkan.
3.5.5 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan
sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam
etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan.
3.5.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah dihaluskan dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, lalu diratakan. Krus
dipijarkan pada suhu 600ºC sampai arang habis, kemudian didinginkan dan
Universitas Sumatera Utara
ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan.
3.5.7 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap,
kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia dilakukan menurut Depkes 1995 alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida antrakinon dan saponin dan Farnsworth
1966 pemeriksaan tanin, triterpenoid steroid dan glikosida sianogenik. 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 10 menit, didinginkan dan
disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloid. Ke dalam 4 tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi :
1. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
2. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
3. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada minimal dua dari tiga reaksi.
Universitas Sumatera Utara
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoid
Serbuk ditimbang sebanyak 0,5 g, lalu ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring. Filtrat
diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, lalu diamkan sebentar. Lapisan metanolnya diambil,
diuapkan pada temperatur 40ºC, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoid dengan cara berikut:
a. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml
etanol 95 , lalu ditambah 0,5 g serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2 N, didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida
pekat. Jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid.
b. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml
etanol 95 , lalu ditambah 0,1 g serbuk magnesium dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu
menunjukkan adanya flavonoid, warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron.
3.6.3 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam,
didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat
disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat
Universitas Sumatera Utara
anhidrat dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut :
1. 0,1 ml larutan percobaan diuapkan, ditambahkan 5 ml asam asetat anhidrid dan
10 tetes asam sulfat pekat. 2.
0,1 ml larutan percobaan dimasukan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish.
Kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan
menunjukkan glikosida. 3.
Serbuk sampel direbus dalam air, didinginkan, disaring. Pada filtrat ditambahkan fehling A dan fehling B 1:1, dipanaskan. Terbentuknya endapan
merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi.
3.6.4 Pemeriksaan Saponin
Serbuk ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama
10 detik. Terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan
adanya saponin. 3.6.5 Pemeriksaan Tanin
Serbuk daun ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1- 2 tetes
pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.
3.6.6 Pemeriksaan TriterpenoidSteroid
Universitas Sumatera Utara
Serbuk ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n-heksan 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan
pereaksi Liebermann-Burchard. Terbentuknya warna ungu atau merah yang berubah menjadi merah ungu atau biru hijau menunjukkan adanya
triterpenoidsteroid. 3.6.7 Pemeriksaan Glikosida Antrakinon
Serbuk ditimbang sebanyak 0,2 g, ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan
didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan
benzen tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon.
3.6.8 Pemeriksaan Glikosida Sianogenik
Sebanyak 0,5 g serbuk dimasukkan ke dalam erlenmeyer, dilembabkan dengan air. Diselipkan kertas saring yang telah dibasahi natrium pikrat pada mulut
erlenmeyer, ditutup, dibiarkan terkena sinar matahari. Jika kertas saring memberikan warna merah, menunjukkan adanya sianogenik glikosida.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 80, kemudian ekstrak etanol dipartisi dengan cara fraksinasi
menggunakan pelarut n-heksan. Cara kerja:
Sejumlah serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah bertutup, dimaserasi dengan pelarut etanol 80 sampai serbuk terendam sempurna, ditutup,
Universitas Sumatera Utara
dibiarkan selama 120 jam terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, disaring. Diperoleh filtrat hasil maserasi maserat. Pengerjaan dilakukan berulangkali
hingga maserat tidak memberikan warna. Maserat yang diperoleh digabungkan, kemudian diuapkan dengan bantuan penguap vakum putar pada suhu ± 40
C sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak etanol yang diperoleh ditambahkan air
suling, lalu difraksinasi dengan n-heksan. Dilakukan berulang kali sampai fraksi n-heksan memberikan hasil negatif terhadap pereaksi Liebermann-Burchard.
Fraksi n-heksan diuapkan. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 39.
3.8 Analisa Fraksi n-heksan Secara KLT
Terhadap fraksi n-heksan dilakukan analisa secara KLT dengan fase diam plat pralapis tipis silika gel GF
254
, menggunakan fase gerak n-heksan-etilasetat dengan berbagai perbandingan yaitu 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5. Sebagai
penampak bercak digunakan pereaksi Liebermann-Burchard. Cara kerja :
Fraksi n-heksan ditotolkan pada plat pralapis tipis silika gel GF
254
, kemudian dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh dengan uap fase gerak.
Setelah elusi selesai, plat dikeluarkan dan dikeringkan, amati bercak yang terjadi dan hitung harga Rf-nya. Plat kemudian disemprot dengan penampak bercak
Liebermann-Burchard, dipanaskan di oven pada suhu 110 C selama 15-20 menit.
Amati bercak yang terjadi dan hitung harga Rf-nya.
3.9 Pemisahan Fraksi n-heksan Dengan Kromatografi Kolom
