Tabel 3.1. Rancangan penelitian isolasi dan penentuan struktur senyawa dari daun tumbuhan kulu Artocarpus camansi: sukun berbiji
yang bersifat antidiabetes
No Aktivitas
1. Pengumpulan sampel dari Daerah Darussalam, Banda Aceh
2. Penghalusan bahan dan pengeringan dalam ruang suhu kamar
3. Uji fitokimia
4. Ekstraksi dengan cara maserasi sampel dengan pelarut heksana
5. Ekstraksi dengan cara maserasi sampel dengan pelarut etil asetat
6. Ekstraksi dengan cara maserasi sampel dengan pelarut metanol
7. Pengujian antidiabetes ekstrak heksana, ekstrak etil asetat, dan ekstrak
metanol terhadap mencit jantan Swiss Webster, dan karakterisasi ekstrak tersebut dengan KG-SM.
8. Isolasi senyawa murni
9. Karakterisasi senyawa murni isolat dan uji antidiabetes senyawa murni
isolat.
3.4 Pelaksanaan Penelitian 3.4.1 Determinasi Tumbuhan
Daun tumbuhan A. camansi diambil dari Daerah Darussalam, Provinsi Aceh, pada Bulan Febuari 2011. Identifikasi dilakukan di Herbarium Medanense,Jurusan
Biologi Universitas Sumatera Utara, Medan. Voucher spesimennya tersimpan di Herbarium USU Medan, dan juga dikirim ke Bogoriense, Bogor.
3.4.2 Pengujian Fitokimia Harborne 1987
Uji Alkaloid
Sampel segar daun A.camansi 4 g dihaluskan kemudian ditambahkan 1 mL amoniak. Selanjutnya ditambahkan 10 mL kloroform, digerus dan disaring. Filtrat
ditambahkan asam sulfat 2 N sebanyak 10 mL, dikocok, didiamkan sampai lapisan
asam dan lapisan kloroform memisah. Lapisan asam diambil dan dibagi dalam tiga tabung dan masing-masing tabung diuji untuk mengetahui keberadaan alkaloid.
Penambahan dengan reagen Mayer akan menyebabkan endapan putih, dengan reagen Dragendorff akan menyebabkan ada endapan kemerahan, dan dengan reagen Wagner
timbul endapan kuning, jika positif ada alkaloid.
Uji Steroid, Terpenoid dan Saponin
Sepuluh gram sampel segar daun A.camansi, digerus halus, kemudian diekstraksi dengan metanol panas. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary
evaporator sehingga diperoleh ekstrak metanol. Ekstrak metanol kemudian diekstraksi lagi dengan dietil eter. Residu yang tidak larut dalam dietil eter dikocok
kuat-kuat. Adanya busa yang stabil selama 30 menit menunjukkan adanya saponin, jika positif adanya saponin, larutan tersebut dihidrolisis dengan HCl dan diuji dengan
reagen Liebermann Burchard. Warna hijau atau biru menunjukkan adanya saponin
steroid dan warna ungu atau merah menunjukkan adanya saponin triterpenoid. Ekstrak dietil eter diuji dengan reagen Liebermann-Bourchard. Warna biru atau hijau
menunjukkan adanya steroid dan warna merah triterpenoid.
Uji Flavonoid
Sampel daun A.camansi sebanyak 10 gram diekstraksi dengan metanol dan dipekatkan. Ekstrak metanol pekat diekstraksi lagi dengan n-heksana. Residu
diekstraksi dengan 10 mL etanol 80, selanjutnya ditambah 0,5 mg logam magnesium dan HCl 0,5 M. Warna merah muda atau ungu menunjukkan adanya
flavonoid.
3.4.3 Isolasi metabolit sekunder dari daun tumbuhan Artocarpus camansi
Blanco
Sampel daun A. camansi yang sudah dikeringanginkan, sebanyak 1,7 kg dalam jumlah basah adalah 6,2 kg, setelah diuji fitokimia dimaserasi dengan pelarut
n-heksana sebanyak 25 L, selama 3x24 jam. Selanjutnya di saring, filtratnya di uapkan dengan rotary evaporator, dari hasil penguapan diperoleh ekstrak heksana
sebanyak 49,02 g. Ampas dari penyaringan dikeringkan dengan cara diangin- anginkan lalu di maserasi kembali dengan pelarut etil asetat sebanyak 10 L sebagai
pelarut semi polar, selama 3x24 jam. Selanjutnya disaring, filtrat di uapkan dengan rotary evaporator, dari hasil penguapan diperoleh ekstrak etil asetat sebanyak 41,58
g. Ampas dari penyaringan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dimaserasi kembali dengan pelarut metanol sebanyak 10 L sebagai pelarut polar,
selama 3x24 jam. Selanjutnya disaring, filtrat diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator dan diperoleh ekstrak metanol. Masing-masing ekstrak ini di uji bioassay
terhadap aktivitas antidiabetes dan diuji fitokimia, dan dianalisis dengan GC-MS di Universitas Pendidikan Indonesia, di Bandung. Hasil uji fitokimia, ekstrak heksana
mengandung triterpenoid dan steroid, sedangkan ekstrak etil asetat tidak mengandung flavonoid, dan ekstrak metanol sebanyak 50,2 g tidak mengandung alkaloid. Hasil
uji antidiabetes dari ke-tiga ekstrak tersebut, yang paling aktif adalah ekstrak heksana, maka isolasi dan pengujian aktivitas diarahkan pada ekstrak heksana. Skema isolasi
ekstrak daun terdapat A.camansi terdapat pada Gambar 3.1 berikut.
Gambar 3.1. Ekstraksi daun Artocapus camansi
Daun kulu Artocarpus
camansi, 1,7 Kg
Determinasi
Uji Fitokimia
+ Steroid Dihaluskan, dan
dimaserasi dengan pelarut n-heksana, 25 L
Disaring
Ampas Filtrat
Diuapkan dengan Rotary evaporator
Ekstrak Heksana 49,02 g
Dimaserasi dengan pelarut
Etil asetat, 10 L Disaring
Ekstrak Etilasetat 41,58 g
Filtrat
Diuapkan dengan Rotary
evaporator
Ampas
Dimaserasi dengan
metanol 10 L, Disaring
Filtrat
Diuapkan dengan Rotary evaporator
Ekstrak Metanol 50,2 g
+ Steroid Aktif antidiabetes
+ Terpenoid, - Flavonoid
- Steroid. Aktif antidiabetes
+ Terpenoid - Alkaloid
Aktif antidiabetes Uji Fitokimia
Uji Aktivitas Antidiabetes
Uji Fito kimia dan Uji Antidiabetes
Uji L-B dan Uji antidiabetes
Ampas
Fraksinasi dan Pemurnian Ekstrak heksana
Sebelum ekstrak heksana difraksinasi dilakukan penentuan eluen yang akan dipakai untuk mengelusi ekstrak heksana tersebut. Eluen yang dipakai adalah n-
heksana 100, n-heksana-etil asetat 9:1; n-heksana-etil asetat 8:2; dan n- heksana-etil asetat 7:3. Pada pengujian eluen dengan heksana 100, diperoleh Rf
0,7; 0,41; 0,29; 0,2; 0,15; 0,13. Pada pengujian n-heksana : etil asetat 9:1 diperoleh RF 0,55; 0,48; 0,37; 0,3; 0,22; 0,12. Pengujian dengan heksana : etil asetat dengan
perbandingan 8:2 diperoleh Rf 0,98; 0,93; 0,92;0,85, dan 0,76. Pada perbandingan n-heksana-etil asetat 7:3 diperoleh Rf 0,99, 0,96, dan 0,94.
Berdasarkan pengujian ini dipakai eluen untuk mengelusi ekstrak heksana adalah n-heksana 100, dan n-heksana: etil asetat: 9:1, karena pada penggunaan n-
heksana 100, dan n-heksana: etil asetat: 9:1, senyawa kimia yang terdapat di dalam ekstrak heksana dapat terpisah, sedangkan pada penggunaan eluen heksana dan etil
asetat dengan perbandingan 8:2, Rf pada noda berdekatan dan mendekati batas garis atas. Selanjutnya dilakukan pemisahan terhadap ekstrak heksana, ekstrak heksana
sebanyak 30 g dipisahkan dengan kromatografi kolom grafitasi KKG dengan menggunakan fasa diam silika gel 60, 70-230 mesh dengan fasa gerak eluen
bertahap yaitu n-heksana 100, dan n-heksana: etil asetat 9:1. Penggunaan heksana:etil asetat 9:1, dimulai pada fraksi 25 dan seterusnya. Panjang kolom
kromatografi yang digunakan 40 cm, dengan diameter 2,5 cm, dan penampungan fraksi setiap 100 mL.
Hasil dari fraksinasi dengan KKG ini diperoleh 59 fraksi, selanjutnya fraksi- fraksi ini dimonitor dan dikelompokkan berdasarkan kandungan steroid yang ada
pada masing-masing fraksi. Hasil pengujian steroid pada masing-masing fraksi adalah sebagai berikut. Fraksi 1-26 tidak mengandung steroid, fraksi 27-29 mengandung
steroid, fraksi 30-59 tidak mengandung steroid. Pengelompokan fraksi-fraksi ini terdapat pada Tabel 3.2 berikut .
Tabel 3.2. Hasil pengelompokan fraksi-fraksi ekstrak heksana No.
Kelompok Fraksi Jumlah g
Keberadaan Steroid
1. A 1-26
- 2.
B 27-29 1,1 g
+ 3.
C 30-59 -
Pada Tabel 3.2, kelompok fraksi A, dan C, mengandung terpenoid, tidak mengandung steroid, pemisahannya tidak diteruskan, sedangkan kelompok fraksi B
27-28-29 sebanyak 1,1 g, mengandung steroid positif steroid. Selanjutnya ke-3 fraksi ini B di KLT, dengan pengembang heksana–etil asetat 9:1 diperoleh pola
noda atau RF sebagai berikut: 0,82; 0,63; 0, 56; 0,45; 0,26; dan 0,2. Selanjutnya fraksi B 27-28-29 digabung, diuapkan dengan rotary
evaporator dan diperoleh beratnya 1,1 g. Kelompok fraksi ini selanjutnya dipisahkan dengan KKG dengan fasa diam silika gel 60 200 mesh, panjang kolom 30 cm, dan
diameter 1 cm. Sebelum dipisahkan ditentukan jenis eluen yang akan digunakan, hasil KLT eluen untuk mengelusi kelompok fraksi B adalah sebagai berikut. Pada
pengujian eluen dengan heksana 100, diperoleh Rf 0,33; 0,26; 0,21; 0,16; 0,1; dan 0,05. Pada pengujian n-heksana-etil asetat 9:1 diperoleh Rf 0,79, 0,71; 0,62; 0,46;
0,31; dan 0,16 dan dengan heksana dan etil asetat dengan perbandingan 8:2 diperoleh Rf 0,95; 0,93; 0,92; 0,86; 0,83; dan 0,76. Pada perbandingan n-heksana-etil
asetat 7:3 diperoleh Rf 0,99; 0,96; 0,95; dan 0,9. Berdasarkan hasil pengujian eluen ini, maka eluen yang digunakan untuk
mengelusi fraksi B adalah n-heksana-etil asetat 9:1, penampungan setiap 10 mL. Pada pemisahan kelompk fraksi B diperoleh 22 fraksi, dan tiap fraksi diuji
keberadaan steroidnya, tabulasinya terdapat pada Tabel 3.3 berikut.
Tabel 3.3. Hasil pemisahan kelompok fraksi B, jumlahnya, dan keberadaan steroidnya
Fraksi Rf
Jumlah g Keberadaan Steroid
1-8 -
- -
9 0,79
0,002 +
10 -
- -
11 0,71
0,003 +
12 -
- -
13 0,62
0,015 +
14 -
- -
15 0,46
0,28 +
16 0,46
17 0,46
18 -
- -
19 -
- -
20 0,31
0,005 +
21 -
- -
22 0,16
0,002 +
Berdasarkan Tabel 3.3, maka fraksi 15-16-17, di gabung dan diuapkan di dalam rotary evaporator, diperoleh beratnya 0,28 g. Skema isolasi dan pemurnian
fraksi-fraksi dalam ekstrak heksana terdapat pada Gambar 3.2 berikut.
Gambar 3.2. Skema fraksinasi dan pemurnian ekstrak heksana daun A.camansi
Ekstrak Heksana 30g
1
-26 A
27-29 B
1,1 g 30-59
C
Pengujian eluen heksana 100, heksana: etil asetat 9:1, heksana :etil asetat 8:2, heksana: etil
asetat 7:3
Kolom kromatografi grafitasi KKG, dengan Sil. Gel 60 70-230 mesh penampungan 100 mL,
hasilnya di identifikasi terhadap keberadaan steroid. Eluen pengembang : Heksan: Etil asetat
9:1
B-I-1 80 mg
Uji Fitokimia
Pengujian Eluen heksana 100, H:EA, 9:1 heksana :etil asetat 8:2, heksana: etil asetat 7:3;
KKG dengan sil. Gel 60 70-230 mesh penampungan 10 mL, Heksan: Etil asetat 9:1
- Steroid + Steroid
- Steroid
B-I 15-17 0,28 g
+ Steroid
Rekristalisasi, dan pencucian
Uji: TL, KLT dengan sistem 3 eluen,Uji antidiabetes.
Karakterisasi dengan: UV, IR,
1
H-NMR,
13
C-NMR HMBC, HSQC, DEPT, COSY.
Senyawa B-I-1 yang sudah hampir bersih direkristalisasi dengan pelarut metanol dan heksana, dan dicuci dengan pelarut heksana diperoleh kristal BI-1
sebanyak 80 mg, sedangkan senyawa BI-1 sisa yang masih mengandung sedikit pengotor masih belum dimurnikan. Selanjutnya senyawa murni yang diperoleh
sebanyak 80 mg tersebut diuji kemurniannya dengan sistem 3 eluen, dengan heksan etil asetat 9:1 memberikan Rf 0,45; dengan, dengan heksana 100 diperoleh Rf
0,30; dengan kloroform 100 , diperoleh Rf 0,89. Kromatogram senyawa BI-1
dengan 3 sistem eluen terdapat pada Gambar 3.3 berikut.
Gambar 3.3. Kromatogram senyawa BI-1 dengan 3 jenis sistem eluen
H:EA 9:1
H: 100
KL: 100
Spl Spl
Spl
Kristal BI-1 yang diperoleh berupa padatan putih, mempunyai titik leleh 77- 80
C. Selanjutnya Senyawa BI-1 dikarakterisasi menggunakan instrument: IR, UV,
1
H-NMR,
13
C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY, untuk mengetahui struktur senyawa tersebut.
3.4.4 Pembuatan Ekstrak dan Sediaan Uji Penyiapan Sediaan Uji
