Alat dan Bahan Prosedur Penelitian

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

- Neraca analitis Ohaus Pioneer - Hot plate Thermo Scientific - Oven Gallenkamp - pH meter WalkLAB - Alat-alat gelas - Magnetic stirer - Penangas air - Statif dan klem - Spatula - Autoklaf - Inkubator - Jangka sorong - Kertas perkamen - Jarum ose

3.1.2 Bahan

- Minyak kelapa Barco - Asam Stearat - Gliserin - Etanol 96 - Asam Klorida pekat p.a E. Merck Universitas Sumatera Utara - NaOH p.a E. Merck - Asam Asetat glacial p.a E. Merck - Kalium Hidroksida p.a E. Merck - Kitosan - Gula - Akuades - Garam - Sodium Lauril Sulfat - Indikator Phenolphtalein - Indikator Metil Jingga - Nutrien Agar NA - Biakan Staphylococcus aureus - Biakan Escherichia coli

3.2 Prosedur Penelitian

3.2.1 Pembuatan Larutan Pereaksi

3.2.1.1 Larutan NaOH 30

Sebanyak 30 gram NaOH dilarutkan dengan akuades, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Kemudian diencerkan sampai garis tanda dan dihomogenkan.

3.2.1.2 Larutan KOH 0,1 N Alkoholis

Sebanyak 1,4 gram KOH pellet dilarutkan dengan 10 ml air, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 250 ml, ditambahkan etanol 96 sampai garis tanda dan dihomogenkan DitJen POM, 1979. Universitas Sumatera Utara

3.2.1.3 Larutan KOH 0,5 N Alkoholis

Sebanyak 7 gram KOH pellet dilarutkan dengan 50 ml air, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 250 ml, ditambahkan etanol 96 sampai garis tanda dan dihomogenkan DitJen POM, 1979.

3.2.1.4 Larutan HCl 0,1 N Alkoholis

Sebanyak 2 ml HCl p 37 diencerkan dengan etanol 96 , kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 250 ml sampai garis tanda dan dihomogenkan DitJen POM, 1979.

3.2.1.5 Larutan CH

3 COOH 1 Sebanyak 10 ml CH 3 COOH glacial diencerkan akuades, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 ml sampai garis tanda dan dihomogenkan.

3.2.1.6 Larutan Kitosan 2

Sebanyak 2 gram kitosan dilarutkan dengan 100 ml CH 3 COOH 1. Catatan : Dilakukan prosedur yang sama untuk kitosan 3 , 4 , 5 . Universitas Sumatera Utara

3.2.2 Pembuatan Larutan Media

3.2.2.1 Pembuatan Nutrien Agar NA

Komposisi : Beef ekstrak 3 gram Pepton 5 gram Agar 12 gram Akuades pH 7,0 ± 0,2 pada 25 C Prosedur: Ditimbang sebanyak 20 g serbuk nutrien agar kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai bahan larut sempurna dan jernih. Tutup erlenmeyer dengan kapas. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Difco, 1977.

3.2.2.2 Pembuatan Larutan NaCl 0,9

Komposisi : NaCl 0,9 gram Air suling steril ad 100 ml Prosedur: Dilarutkan 0,9 gram NaCl dengan air suling steril sedikit demi sedikit dalam labu takar 100 ml sampai larut sempurna, dicukupkan sampai garis tanda, dimasukkan ke dalam erlenmeyer steril yang bertutup, disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 C pada tekanan 1 atm selama 15 menit. Universitas Sumatera Utara

3.2.2.3 Pembuatan Suspensi Standart Mc. Farland

Suspensi standart yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan suspensi bakteri dengan 10 8 CFUml. Komposisi : Larutan asam sulfat 1 9,5 ml Larutan barium klorida 1, 175 bv 0,5 ml Prosedur: Dicampurkan larutan asam sulfat 1 dan larutan barium klorida 1,175 dalam tabung reaksi steril, di kocok sampai homogen dan di tutup. Apabila kekeruhan hasil suspensi bakteri sama dengan suspensi standart berarti konsentrasi bakteri 10 8 CFUml DepKes RI, 1995.

3.2.2.4 Pembuatan Media Agar Miring

10 ml media agar yang telah di masak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, di tutup dan di bungkus lalu disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C. Kemudian tabung yang berisi agar diletakkan pada kemiringan 30-45 , diperhatikan bahwa agar tidak menyentuh tutup tabung. Agar dibiarkan menjadi dingin dan keras.

3.2.2.5 Pembuatan Stok Kultur Bakteri

Masing-masing sebanyak 1 ose dari biakan murni bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus digoreskan dengan metode sinambung pada permukaan nutrien agar, di tutup mulut tabung reaksi dengan kapas. Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 C Lay, 1994. Universitas Sumatera Utara

3.2.2.6 Pembuatan Inokulum Bakteri

Bakteri hasil inkubasi disuspensikan dengan menggunakan jarum steril ke dalam tabung yang berisi 10 ml larutan NaCl 0,9 steril, kemudian dihomogenkan hingga diperoleh kekeruhan suspensi bakteri yang sama dengan kekeruhan standart Mc. Farland, ini berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 10 8 CFUml. Setelah itu dilakukan pengenceran dengan memipet 0,1 ml biakan bakteri 10 8 CFUml, dimasukkan ke dalam tabung steril yang berisi larutan NaCl 0,9 sebanyak 9,9 ml dikocok homogen, maka suspensi bakteri dengan konsentrasi 10 6 CFUml Lay, 1994.

3.2.3 Formula Sabun Transparan

Tabel 3.1Formula Sabun Transparan No Bahan Komposisi berat 1 Asam stearat 8 2 Minyak kelapa 20 3 NaOH 30 22 4 Etanol 16 5 Gliserin 16 6 Gula 8,5 7 SLS 3 8 Asam Sitrat 3 9 NaCl 0,5 10 Kitosan 2 11 Parfum 1 Sumber : Modifikasi Qisti 2009. Universitas Sumatera Utara

3.2.4 Pembuatan Sabun Transparan

Dicairkan asam stearat kemudian dicampurkan dengan minyak kelapa pada suhu 70-80 C, kemudian diaduk sampai homogeny. Setelah homogen, ditambahkan larutan NaOH 30, diaduk hingga terbentuk padatan sabun. Ditambahkanetanol 96 untuk melarutkan padatan sabun dan diaduk hingga terbentuk sabun transparan dasar. Kemudian ditambahkan bahan-bahan pendukung seperti gliserin, larutan gula, sodium lauril sulfat, asam sitrat, dan garam. Setelah itu ditambahkan parfum pada suhu 50 C. Dimasukkan kedalam cetakan dan didinginkan pada suhu ruangan sampai sabun transparan memadat Qisti, 2009. Catatan: Dilakukan prosedur yang sama untuk pembuatan sabun transparan dengan penambahan kitosan 2 , 3 , 4 , dan 5 pada suhu 50 C.

3.2.5 Pengujian Terhadap Sabun

3.2.5.1Pengujian pH SNI 06-3532-1994 Sampel dihaluskan kemudian ditimbang sebanyak 1 gram, dimasukkan ke dalam beaker glass dan dilarutkan dengan akuades, dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda. Setelah itu dilakukan pengukuran pH dengan cara memasukkan pH meter yang telah dikalibrasi kedalam larutan pH 7 dan pH 10 kemudian dimasukkan kedalam sabun yang telah dicairkan, diamkan beberapa saat hingga didapat pH yang tetap.

3.2.5.2 Pengujian Kadar Air SNI 06-3532-1994

Pengukuran kekurangan berat setelah pengeringan pada suhu 105 C. Ditimbang dengan teliti 4 gram sabun dengan menggunakan botol timbang yang telah Universitas Sumatera Utara diketahui berat tetapnya, dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 C selama 2 jam sampai berat tetap. Perhitungan: Kadar air = �1−�2 � � 100 Keterangan: W 1 = berat sampel + berat botol timbang gram W2 = berat sampel setelah pengeringan gram W = berat sampel gram

3.2.5.3 Pengujian Asam Lemak BebasAlkali Bebas SNI 06-3532-1994

Disiapkan alkohol netral dengan mendidihkan 100 ml alkohol dalam labu erlenmeyer 250 ml, ditambahkan 0,5 ml indikator phenolphtalein dan didinginkan sampai suhu 70 C, kemudian netralkan dengan KOH 0,1 N dalam alkohol. Ditimbang sebanyak 5 gram sabun, dimasukkan ke dalam alkohol netral diatas, ditambahkan batu didih, dipasang pendingin tegak dan dipanaskan agar cepat larut diatas penangas air, dididihkan selama 30 menit. Apabila larutan tidak bersifat alkalis tidak berwarna merah, didinginkan sampai suhu 70 C dan titrasi dengan larutan KOH 0,1 N dalam alkohol, sampai timbul warna merah yang tahan sampai 15 detik. Perhitungan: Kadar Asam Lemak Bebas = � � � � 0,205 � �� 100 Keterangan: V = KOH 0,1 N yang diperlukan N = normalitas KOH yang diperlukan W = berat sampel 205 = berat setara asam laurat Universitas Sumatera Utara Bila berat sampel sabun mengandung banyak bagian yang tidak larut, agar tidak mengganggu, saring terlebih dahulu sebelum titrasi dilakukan. Apabila larutan tersebut diatas ternyata bersifat basa petunjuk phenolphtalein berwarna merah, maka yang diperiksa bukan asam lemak bebas tetapi alkali bebas dengan mentitrasinya menggunakan HCl 0,1 N dalam alkohol dari buret mikro, sampai warna merah tepat hilang. Perhitungan: Kadar Alkali Bebas Dihitung NaOH = � � � � 0,04 � �� 100 Keterangan: V = ml HCl yang dipergunakan N = normalitas HCl yang dipergunakan 40 = berat setara NaOH

3.2.5.4 Pengujian Minyak Mineral SNI 06-3532-1994

Sebanyak 5 gram sabun dimasukkan ke dalam gelas piala, ditambah air dan dipanaskan hingga larut. Ditambahkan HCl 10 berlebihan sehingga indikator metil jingga berwarna merah dan seluruh asam lemak, lemak netral dan bagian yang tidak mungkin dapat disabunkan akan memisah di lapisan atas. Dimasukkan ke dalam corong pemisah dan lapisan air dikeluarkan. Dipipet 0,3 ml lapisan lemak, ditambahkan 5 ml KOH 0,5 N berlebih dalam alkohol, dipanaskan sampai reaksi penyabunan sempurna menggunakan erlenmeyer yang dilengkapi pendingin tegak di didihkan selama 2 menit di atas penangas air. Ditetesi dengan air setetes demi setetes. Jika terjadi kekeruhan berarti minyak mineral positif. Jika larutan tetap jernih berarti minyak mineral negatif kurang dari 0,5 SNI 06- 3532-1994. Universitas Sumatera Utara

3.2.5.5 Uji Aktivitas Bakteri DepKes RI, 1995

Aktivitas sabun transparan diuji dengan menggunakan biakan bakteriEscherichia coli dan Staphylococcus aureusserta larutan uji berupa sediaan sabun transparan yang dilarutkan dalam etanol 96 atau akuades panas, disiapkan sesuai dengan konsentrasi 10 mgml, 20 mgml, 30 mgml, 40 mgml, dan 50 mgml . Setelah itu, disiapkan cawan petri berisi media agar. Pada setiap cawan petri dibuat lubang. Inokulasikan masing-masing bakteri ke dalam media agar sebesar 10 6 CFUmL sesuai standar inokulum dari National Committe for Clinical Laboratory Standard NCCLS, sebanyak 0,1 ml. Larutan uji dengan beberapa konsentrasi seperti tersebut di atas kemudian dimasukkan sebesar 0,1 ml pada masing-masing lubang yang ada. Inkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Konsentrasi hambat minimum KHM diketahui dengan mengukur zona hambat yang terbentuk di sekitar lubang. Universitas Sumatera Utara

3.2.6 Bagan Penelitian

3.2.6.1 Pembuatan Sabun Transparan

Catatan: Dilakukan prosedur yang sama untuk pembuatan sabun transparan dengan penambahan kitosan 2 , 3 , 4 , dan 5 pada suhu 50 C Qisti, 2009. Ditambahkan 8 ml asam stearat yang telah dicairkan pada suhu 70-80 C Diaduk hingga homogen Ditambahkan 23 ml NaOH 30 diaduk sampai terbentuk padatan sabun Ditambahkan bahan-bahan pendukung seperti gliserin, larutan gula, sodium lauril sulfat, asam sitrat, dan garam Dimasukkan ke dalam cetakan Didinginkan Ditambahkanetanol 96 untuk melarutkan padatan sabun dan diaduk hingga terbentuk sabun transparan dasar Ditambahkan parfum pada suhu 50 C 20 ml minyak kelapa Sabun transparan Universitas Sumatera Utara

3.2.6.2 Pengujian pH SNI 06-3532-1994

3.2.6.3 Pengujian Kadar Air SNI 06-3532-1994

Dimasukkan ke dalam kaca arloji Ditimbang sabun + kaca arloji sebelum pengeringan Dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105 C sampai mendapat berat konstan Dikeluarkan dari oven Ditimbang sabun + kaca arloji sesudah pengeringan Dihitung selisih berat awal dan berat akhir sabun 4 gr sabun Hasil Dilarutkan dengan akuades Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan dicukupkan dengan akuades sampai garis tanda Dimasukkan ke dalam beaker gelas Dikalibrasi pHmeter dengan larutan buffer pH 7 dan pH 10 Dicelupkan elektroda pH meter ke dalam larutan sabun Dicatat nilai pH 1 gr sabun Dihaluskan Hasil Universitas Sumatera Utara

3.2.6.4 Pengujian Asam Lemak BebasAlkali Bebas SNI 06-3532-1994

Ditambahkan phenolftalein sebanyak 3 tetes Dipanaskan kemudian didinginkan Dinetralkan dengan KOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah lembayung Ditambahkan 5 gr sabun Dimasukkan batu didih Dipanaskan selama 30 menit Didinginkan Dihitung volume HCL 0,1 N yang habis terpakai 100 ml Alkohol 96 Alkohol netral Larutan merah lembayung Larutan tidak berwarna Hasil Hasil Titrasi dengan HCl 0,1 N sampai warna menjadi bening Titrasi dengan KOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah lembayung Dihitung volume KOH 0,1 N yang habis terpakai Ditambahkan phenolftalein sebanyak 3 tetes Dipanaskan kemudian didinginkan Dinetralkan dengan KOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah lembayung Ditambahkan 5 gr sabun Dimasukkan batu didih Dipanaskan selama 30 menit Didinginkan Dihitung volume HCL 0,1 N yang habis terpakai 100 ml Alkohol 96 Alkohol netral Larutan merah lembayung Larutan tidak berwarna Hasil Hasil Universitas Sumatera Utara

3.2.6.5 Pengujian Minyak Mineral SNI 06-3532-1994

Dimasukkan ke dalam beaker glas Dilarutkan dengan 10 ml akuades panas Ditambahkan 3 tetes indikator metil jingga Ditambahkan larutan HCL 10 berlebih sampai terbentuk warna merah muda Dimasukkan kedalam corong pisah sampai terbentuk dua lapisan Dipipet 0,3 ml Ditambahkan 5 ml KOH 0,5 N alkoholis Dikeluarkan dari corong pisah Dipanaskan selama 2 menit Ditambahkan air setetes demi setetes 5 gr sabun transparan Lapisan minyak Lapisan air Larutan jernih Minyak mineral positif Larutan keruh Larutan jernih Minyak mineral negatif Universitas Sumatera Utara

3.2.6.6 Pembuatan Media Padat Nutrien Agar dan Media Agar Miring Difco, 1977

Disuspensikan didalam erlenmeyer dengan akuades sedikit demi sedikit hingga 1000 ml Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan menjadi jernih Ditutup erlenmeyer dengan kapas Disterilkan didalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Dimasukkan sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi Dibiarkan hingga memadat dalam keadaan miring 30- 45 Ditutup rapat dengan kapas Disterilkan didalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit 20 g Nutrien Agar Hasil Media Nutrien Agar Universitas Sumatera Utara Dipipet 0,1 ml Dimasukkan ke dalam cawan petri

3.2.6.7 Penentuan Aktivitas Antibakteri DepKes, 1995

Catatan: - Dilakukan prosedur yang sama dengan variasi berat sabun; 200 mg, 300 mg, 400 mg, dan 500 mg - Dilakukan prosedur yang sama untuk pelarut akuades panas - Dilakukan prosedur yang sama terhadap suspensi bakteri Staphyloccus aureus 100 mg sabun Dibuat lubang punch hole pada media NA yang terdapat di dalam cawan petri Diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam Diukur zona hambat yang terbentuk disekitar lubang Ditetesi 0,1 ml larutan sabun Dilarutkan dengan 10 ml etanol 96 Suspensi bakteri E. coli Bakteri pada media NA Hasil Larutan sabun Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN