e. Estimasi kadar enzim bromelain
Berdasarkan hasil dari prosedur 5 d untuk BSA dan ekstrak kulit buah nanas kemudian dihitung nilai kadar enzim.
6. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan
Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj 2016
dengan beberapa modifikasi.
a. Pembuatan larutan DPPH
DPPH sebanyak 15,8 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam metanol p.a. hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan DPPH sebesar 0,4
mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan standar rutin
Rutin sebanyak 5,0 mg dilarutkan ke dalam metanol p.a hingga 100,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 2,0; 3,0; 4,0; 5.0 dan 6,0 mL lalu ditambah
dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 10, 15, 20, 25, dan 30 µgmL.
c. Pembuatan larutan uji
Ekstrak kulit buah nanas sebanyak 250,0 mg ditimbang dan dilarutkan ke dalam aquadest hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 3,0; 3,5;
4,0; 4,5 dan 5,0 mL lalu ditambah dengan aquadest 5°C hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0
mgmL. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7. Uji Aktivitas Antioksidan
Metode yang digunakan berdasarkan pada penelitian oleh Thangaraj 2016 dengan beberapa modifikasi.
a. Uji Pendahuluan
Dalam tiga buah tabung reaksi, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH dan air deionisasi, larutan rutin 25 µgmL, dan larutan bromelain 5
mgmL sebanyak 1,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a sebanyak 3 mL. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama
30 menit. Setelah 30 menit, perubahan warna dari ketiga larutan diamati. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
b. Penentuan operating time OT
Dalam tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH dan larutan rutin 5, 15, dan 25 µgmL sebanyak 1,0 mL kemudian
ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometes visibel
pada panjang gelombang 517 nm tiap 5 menit selama 1 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
c. Penetapan panjang gelombang maksimum
Dalam tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah dengan larutan DPPH sebanyak 0,5; 1,0; dan 1,5 mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a
hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH sebesar 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan dimasukan ke dalam tabung reaksi dan divortex selama
30 detik, lalu didiamkan selama OT. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 400-600 nm.
d. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH
Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT, larutan dibaca
serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
e. Pengukuran absorbansi larutan uji
Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri
konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT.
Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3
kali. f.
Estimasi aktivitas antioksidan Berdasarkan hasil dari prosedur 7 d dan e untuk rutin dan ekstrak bromelain
kemudian dihitung niai IC dan IC
50
.
F. Analisis Hasil
Kadar protein total dalam ekstrak kulit buah nanas dinyatakan sebagai persentase. Nilai absorbansi larutan uji dimasukan ke dalam persamaan regresi
linier kurva baku BSA dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan baku, sedangkan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
sumbu y adalah absorbansi sehingga diperoleh konsentrasi protein total yang kemudian dikonversi menjadi persentase kadar protein total dalam ekstrak kulit
buah nanas. Aktivitas penangkapan radikal DPPH IC dihitung berdasarkan rumus:
Absorbansi larutan kontrol − Absorbansi larutan pembandinguji Absorbansi larutan kontrol
×
Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC
50
menggunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding,
sedangkan sumbu y adalah IC. Data lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidaknya
perbedaan bermakna antara nilai IC
50
larutan pembanding dan larutan uji. Analisis statistik dilakukan dengan panduan Bolton dan Bon 2010 dan dengan software R
3.2.5. Nilai IC
50
diuji dengan Shapiro-Wilk untuk mengetahui distribusi data tiap kelompok. Apabila didapat distribusi data yang normal maka analisis dilanjutkan
dengan uji F dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui homogenitas data kelompok. Apabila didapat data yang homogen maka analisis dilanjutkan dengan
uji T-Independent untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05. Apabila didapat data
yang tidak homogen maka analisis dilanjutkan dengan uji T-Independent unequal variances
Welch’s T-test untuk melihat kebermaknaan perbedaan tiap kelompok. Apabila didapatkan distribusi tidak normal, maka analisis dilanjutkan dengan uji
Lavene dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui homogenitas data kelompok. Analisis dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk melihat perbedaan
antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05.
26
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Buah
Determinasi merupakan sebuah tahap awal dalam sebuah penelitian dengan menggunakan tanaman. Determinasi tanaman bertujuan untuk mengetahui
kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian serta untuk meminimalisir akan adanya kesalahan yang terjadi ketika melakukan pengambila n
sampel. Jaminan kebenaran sampel sangat penting karena pada buah nanas terdiri dari berbagai macam varietas. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium
Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, pada tanggal dengan acuan buku Flora of Java Backer dan van Den Brink, 1963.
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Bahan yang diperlukan adalah kulit buah nanas. Bahan tanaman pada penelitian ini diperoleh dari Pasar Stan, Maguwoharjo, Yogyakarta. Buah nanas
yang digunakan adalah buah nanas yang masih muda dan dibeli dari satu orang penjual saja pada hari yang sama. Pertimbangan tersebut dikarenakan dengan umur
buah nanas yang masih muda diharapkan kandungan bromelain yang masih tinggi dan untuk diharapkan buah nanas yang diperoleh berasal dari tempat tumbuh yang
sama, serta varietas yang sama. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
C. Hasil Preparasi Sampel
Kulit buah nanas yang telah dikupas dari daging buah kemudian diblender untuk mendapatkan ukuran partikel yang lebih kecil. Ukuran partikel yang lebih
kecil akan membuat luas permukaan sampel yang mengalami kontak dengan pelarut semakin besar. Kontak dengan pelarut yang semakin besar akan
memudahkan pelarut untuk menarik senyawa yang diinginkan. Adanya kontak antar penyari dengan sampel mengakibatkan adanya kesempatan penyari untuk
masuk menembus membran sel dan menarik senyawa yang diinginkan Rahayu, 2009. Air deionisasi digunakan sebagai pelarut karena dapat melarutkan enzim
bromelain yang bersifat hipofilik yang terkandung di dalam kulit buah nanas. Kulit buah yang telah diblender kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang
dilapisi dengan kain katun dengan bantuan pompa vakum. Hasil penyaringan yang telah didapat kemudian didinginkan sampai pada
suhu 4
o
C. Hal ini berguna untuk menjaga supaya enzim tidak rusak dan tetap stabil serta menjaga keberadaan aktivitas dari enzim bromelain. Selain itu, menurut
Dennison 2003, menjaga proses ekstraksi dalam keadaan dingin dapat menjaga enzim dari denaturasi dan degradasi. Hal ini disebabkan enzim secara struktur
sangat labil dan sangat rentan terhadap degradasi mikroba. Denaturasi dan degradasi dapat diminimalisir dengan menjaga enzim dalam keadaan dingin pada
suhu 4
o
C. Filtrat kemudian disentrifugasi supaya enzim kasar terpisah dari sisa-sisa jaringan nanas. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
Hasil sentrifugasi yang didapat berupa endapan yang merupakan sisa-sisa jaringan nanas dan supernatan yang mengandung enzim kasar bromelain. Supernatan yang
mengandung bromelain diambil sebagai crude extract. Crude extract umumnya mempunyai aktivitas yang rendah karena masih merupakan campuran dari beberapa
enzim dan ada kemungkinan masih terkandung senyawa-senyawa yang lain selain enzim. Purifikasi dilanjutkan dengan pendinginan ekstrak kasar pada suhu 4°C,
kemudian dilakukan penambahan etanol dingin 90 dengan perbandingan 1:3. Campuran kemudian diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer untuk
membantu etanol menarik senyawa-senyawa selain bromelain untuk terpisah. Etanol merupakan pelarut organik yang sesuai untuk memisahkan senyawa selain
bromelain karena menurut Englard dan Seifter 1990, pelarut organik seperti etanol akan mengakibatkan
pengendapan terhadap protein. Campuran kemudian didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin. Hal ini untuk memberi waktu
bagi campuran untuk terpisah membentuk endapan koloidal, dimana bromelain tidak larut dalam pelarut organik.
Endapan koloidal yang telah terbentuk kemudian dipisahkan dari campuran hingga hanya tersisa endapan koloidal dengan etanol yang masih tersisa sedikit di
dalam campuran. Campuran kemudian dihilangkan sisa etanolnya dengan rotary evaporator. Proses dalam rotary evaporator ini dilakukan pada suhu 50
o
C untuk menjaga kandungan enzim bromelain yang ada didalam ekstrak kulit buah nanas
tetap stabil. Prinsip kerja dari rotary evaporator ini adalah memisahkan campuran dari pelarutnya dengan adanya penurunan tekanan, sehingga pelarut akan lebih
cepat menguap di bawah titik didihnya dan senyawa yang dituju dari pemisahan pelarut ini tidak mengalami kerusakan. Langkah selanjutnya dilakukan pemekatan
di atas waterbath. Pemekatan ini dilakukan untuk menghilangkan sisa etanol dalam PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ekstrak kulit buah nanas hingga didapatkan bobot tetap dari ekstrak. Ekstrak kental yang telah didapat kemudian ditimbang bobot tetapnya. Bobot tetap menurut
Faarmakope Indonesia 1979 adalah bobot yang telah mengalami penimbanga n dua kali berturut-turut tidak mengalami perubahan lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa
yang ditimbang. Bobot ekstrak kulit buah nanas yang didapat sebesar 3,299 gram dengan rendemen yang didapat sebesar 1,5713. Pada penelitian ini tidak
dilakukan fraksinasi karena belum diketahui secara pasti kandungan senyawa yang ada pada ekstrak kulit buah nanas yang dibuat, sehingga hanya digunakan ekstrak
kulit buah nanas.
D. Hasil uji pendahuluan
1. Uji Ninhidrin
Uji ninhidrin merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui adanya keberadaan protein yang diharapkan pada kulit buah nanas. Uji ini merupakan uji
kualitatif yang menjadi dasar untuk uji kuantitaf penetapan kadar enzim bromelain. Uji dengan metode ninhidrin ini menghasilkan warna ungu
Ruherman’s Purple jika dalam reaksi yang diujikan terdapat asam amino Boyer, 2011. Uji ini
merupakan uji yang cepat dan sensitive dalam mendeteksi asam amino, protein, dan peptide. Akan tetapi uji ini tidak mampu memberikan hasil yang selektif sehingga
tidak bisa digunakan untuk menentukan asam amino dalam tingkat yang lebih spesifik.
Gambar 1. Reaksi Ninhidrin dengan protein Bottom, Hanna dan Siehr, 1978
Ninhidrin akan bereaksi dengan gugus amino alfa yang terdapat dalam asam amino, peptida dan protein. Karena terjadi reaksi antara ninhydrin dengan gugus
amino alfa maka akan terbentuk hidrindantin. Ninhidrin kemudian akan berinteraksi dengan hidrindantin dan NH
3
untuk membentuk senyawa yang mampu
menghasilkan warna ungu.
Gambar 2. Hasil uji ninhidrin
