Polymerase Chain Reaction PCR

Handoyo dan Rudiretna, 2001. Enzim yang paling sering digunakan yaitu taq polymerase yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus, bakteri ini dapat bertahan pada tahap denaturasi dengan temperatur 95ºC dalam waktu 1-2 menit dan memiliki waktu paruh lebih dari 2 jam pada suhu ini Turner et al., 2005. Langkah awal metode PCR yaitu mengisolasi sampel DNA dari bahan klinis atau menggunakan jaringan yang disimpan pada parafin, kemudian dilakukan proses amplifikasi DNA yang telah diisolasi. Pada prinsip kerja teknik PCR terdapat beberapa tahap amplifikasi, antara lain denaturasi, primer annealing dan elongasi polimerisasi Novel dkk., 2011. Tahap awal amplifikasi yaitu denaturasi, pada tahap ini terjadi proses perubahan untaian DNA ganda menjadi untaian DNA tunggal dengan menggunakan suhu 95ºC dan biasanya dilakukan dalam waktu 60 detik Turner et al., 2005. Untaian ganda DNA template tersebut dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian dilakukan pendinginan agar mencapai suhu tertentu yang diinginkan, sehingga memberi waktu untuk primer dapat menempel annealing pada daerah tertentu dari DNA target Handoyo dan Rudiretna, 2001. Penempelan primer merupakan tahap kedua dari prinsip kerja PCR yang dilakukan pada suhu 55ºC dalam waktu 30 detik Turner et al., 2005. Suhu penempelan primer bergantung pada kandungan GC dan T m ºC dari primer yang didesain Borah, 2011. Tahap ketiga yaitu tahap elongasi atau polimerisasi yang dilakukan pada suhu 72ºC dalam waktu 60-90 detik, agar tahap polimerasi dapat berjalan lebih optimal maka digunakan dNTPs dan Mg 2+ dalam campuran reaksinya Turner et al., 2005. Pada tahap elongasi atau polimerisasi digunakan enzim DNA polimerase yang berfungsi untuk memperpanjang primer dengan adanya dNTPs dATPs, dCTPs, dGTPs dan dTTPs dan buffer yang sesuai Handoyo dan Rudiretna, 2001. Pada teknik PCR umumnya dilakukan dalam siklus 20-45 sesuai kebutuhan. Kemudian diakhir tahap reaksi dilakukan pendinginan pada suhu kamar 4ºC bergantung pada aplikasi dan jenis cycler yang digunakan McPherson dan Moller, 2006. Metode PCR tidak sepenuhnya efisien, maka dari itu perlu dilakukan pengembangan variasi metode PCR untuk meningkatkan efisiensinya. Beberapa modifikasi PCR yang dapat dilakukan untuk pengembangannya antara lain Multiplex PCR, Nested PCR, Reverse Transcriptase PCR dan Real-time PCR Turner et al., 2005. Nested PCR digunakan saat dalam proses deteksi memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi pada produk selama proses amplifikasi berlangsung dari penyatuan primer yang tidak diperlukan. Metode ini menggunakan dua set primer untuk mendukung proses deteksi Yusuf, 2010. Reverse Transcriptase PCR digunakan untuk mengkopi RNA menjadi cDNA menggunakan reverse transcriptase, kemudian mengamplifikasi cDNA dengan PCR dan primer yang spesifik. Pada multiplex PCR menggunakan beberapa set primer dan penambahan beberapa pasang primer ini dapat mengamplifikasi lebih dari satu fragmen DNA dan fragmen tersebut akan dengan mudah dibedakan pada gel jika fragmen tersebut memiliki panjang yang berbeda. Multiplex PCR sering digunakan untuk mendeteksi mikroorganisme yang mengontaminasi air atau makanan dan mikroorganisme yang menginfeksi jaringan Turner et al., 2005.

2.7 Real-Time Polymerase Chain Reaction Real-Time PCR

Real-time PCR merupakan modifikasi atau variasi metode PCR yang memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan beberapa teknik PCR lain. Real time PCR memberikan keuntungan seperti thermal cycler yang dapat menentukan jumlah produk hasil reaksi dengan cara mendeteksi peningkatan ikatan dye dengan DNA sintesis menggunakan fluorometer. Keuntungan lain yang diberikan oleh metode ini antara lain memiliki sensitivitas yang tinggi; reprodusibel menguantifikasi jumlah awal dari template dengan cara memonitoring produk amplifikasi PCR selama proses berlangsung; proses pendeteksian cepat; menganalisis beberapa gen secara simultan; mudah untuk mengolah banyak sampel dan tidak membutuhkan pengecekan akhir menggunakan gel Turner et al., 2005; McPherson dan Moller, 2006.

2.8 DNA Probe

Probe adalah molekul asam nukleat yang memiliki afinitas kuat dan dapat berikatan dengan target DNA secara spesifik atau RNA sekuens. Probe dan sekuens basa dari target harus komplemen satu sama lain. Probe dapat digunakan untuk berbagai metode blotting dan teknik in situ untuk mendeteksi sekuens asam nukleat, selain itu probe juga digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme dan mendiagnosis terjadinya infeksi atau penyakit lainnya Walker dan Rapley, 2005. DNA probe merupakan salah satu komponen dari real-time PCR yang dapat menentukan keberhasilan proses deteksi pada metode real-time PCR. Kriteria DNA probe yang harus dipenuhi dalam melakukan perancangan, sebagai berikut: a Panjang Nuklrotida DNA Probe Panjang nukleotida untuk sebuah DNA probe yang digunakan berkisar antara 18-30 basa dengan panjang optimal 20 nukleotida. Panjang yang melebihi 30 nukleotida masih dapat digunakan dengan catatan bahwa quencher fluoresen tidak ditempatkan pada basa paling ujung 3’, melainkan diposisi tengah dari sekuens DNA probe, Meuer et al., 2001; McPherson dan Moller, 2006. b Kandungan GC GC Kandungan GC yang harus dimiliki DNA probe pada umumnya yaitu 40-60 Borah, 2011. c T m ºC Temperature Melting DNA probe yang baik harus memiliki T m ºC lebih tinggi 5-10ºC dibandingkan T m ºC primer Anonim c, 2006. d Runs Runs menunjukkan pengulangan basa yang sama berturut-turut pada untai DNA probe, contohnya AGCGGGGGATGGGG. DNA probe yang baik seharusnya memiliki runs kurang dari 4 basa Borah, 2011. e Repeats Repeats menunjukkan pengulangan di nukleotida yang sama berturut- turut pada untai DNA probe, contohnya ATATATAT. DNA probe yang baik seharusnya memiliki repeats kurang dari 4 basa Borah, 2011.