titik merupakan mutasi yang terjadi pada RRDR Rifampin Resistance Determining Region
gen rpoB bakteri M. tuberculosis. Beberapa penelitian menyatakan bahwa 90 isolat M. tuberculosis dengan rifampisin fenotip terdapat
missens mutations yang mengakibatkan substitusi asam amino Ser-531 41,
His-526 40 dan Asp-516 5 Yue et al., 2003.
2.6 Polymerase Chain Reaction PCR
Polymerase Chain Reaction PCR merupakan metode untuk membuat
salinan segmen yang spesifik dari suatu untai DNA Campbell et al., 2002. Metode ini digunakan untuk mengamplifikasi urutan DNA menggunakan
sepasang primer yang masing-masing komplemen pada satu ujung urutan target DNA Turner et al., 2005. Metode PCR pertama kali diperkenalkan oleh Karry
Mullis pada tahun 1985 yang digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali dalam waktu beberapa jam saja Handoyo dan
Rudiretna, 2001. Kelebihan metode ini yaitu lebih cepat dibandingkan pengkloningan gen dengan DNA plasmid ataupun DNA faga yang dilakukan
secara in vitro Campbell et al., 2002, selain itu kelebihan lain yang dimiliki PCR yaitu dapat bekerja menggunakan komponen dalam jumlah yang sedikit Novel
dkk., 2011. Metode PCR memerlukan beberapa komponen dalam reaksinya, antara lain
template DNA; sepasang primer; dNTPs Deoxynucleotida triphosphate; buffer
PCR; magnesium klorida dan enzim DNA polimerase. Enzim yang digunakan yaitu DNA polimerase yang diperoleh dari isolasi bakteri termofilik dan
hipertermofilik, maka dari itu enzim ini bersifat termostabil sampai suhu 95ºC
Handoyo dan Rudiretna, 2001. Enzim yang paling sering digunakan yaitu taq polymerase
yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus, bakteri ini dapat bertahan pada tahap denaturasi dengan temperatur 95ºC dalam waktu 1-2 menit
dan memiliki waktu paruh lebih dari 2 jam pada suhu ini Turner et al., 2005. Langkah awal metode PCR yaitu mengisolasi sampel DNA dari bahan klinis
atau menggunakan jaringan yang disimpan pada parafin, kemudian dilakukan proses amplifikasi DNA yang telah diisolasi. Pada prinsip kerja teknik PCR
terdapat beberapa tahap amplifikasi, antara lain denaturasi, primer annealing dan elongasi polimerisasi Novel dkk., 2011. Tahap awal amplifikasi yaitu
denaturasi, pada tahap ini terjadi proses perubahan untaian DNA ganda menjadi untaian DNA tunggal dengan menggunakan suhu 95ºC dan biasanya dilakukan
dalam waktu 60 detik Turner et al., 2005. Untaian ganda DNA template tersebut dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian dilakukan pendinginan agar
mencapai suhu tertentu yang diinginkan, sehingga memberi waktu untuk primer dapat menempel annealing pada daerah tertentu dari DNA target Handoyo dan
Rudiretna, 2001. Penempelan primer merupakan tahap kedua dari prinsip kerja PCR yang dilakukan pada suhu 55ºC dalam waktu 30 detik Turner et al., 2005.
Suhu penempelan primer bergantung pada kandungan GC dan T
m
ºC dari primer yang didesain Borah, 2011. Tahap ketiga yaitu tahap elongasi atau polimerisasi
yang dilakukan pada suhu 72ºC dalam waktu 60-90 detik, agar tahap polimerasi dapat berjalan lebih optimal maka digunakan dNTPs dan Mg
2+
dalam campuran reaksinya Turner et al., 2005. Pada tahap elongasi atau polimerisasi digunakan
enzim DNA polimerase yang berfungsi untuk memperpanjang primer dengan
