31
BAB III METODE PENELITIAN
III.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan dengan mengambil sampel A.aegypti dari rumah-rumah pasien di 5 kecamatan endemis DBD di wilayah Medan, Sumatera Utara, yaitu
Medan Helvetia, Medan Amplas, Medan Selayang, Medan Baru dan Medan Sunggal dari bulan September sampai dengan November 2008. Sampel-sampel tersebut
diperiksa dengan menggunakan metode reverse transcriptase-polymerase chain reaction RT-PCR di laboratorium Mikrobiologi Klinik RS H.Adam Malik Medan.
III.2. Subjek Penelitian
Nyamuk Aedes aegypti betina dari rumah-rumah pasien di 5 kecamatan di
kota Medan, yakni Medan Helvetia, Medan Selayang, Medan Sunggal, Medan Baru dan Medan Amplas.
III.3. Rancangan Penelitian
Penelitian dilakukan secara deskriptif terhadap 100 sampel nyamuk Aedes aegypti betina di SMF laboratorium Mikrobiologi Klinik RS H. Adam Malik Medan
yang dikumpulkan dari masing-masing 5 lokasi endemis DBD di kota Medan yaitu Medan Helvetia, Medan Selayang, Medan Sunggal, Medan Baru, Medan Amplas
yang ditangkap dari masing-masing Kecamatan endemis DBD menurut data
Puskesmas atau Dinas Kesehatan kota Medan. Kebutuhan 100 sampel nyamuk A.aegypti betina dalam penelitian ini didasarkan pada rumus :
n ≥ z
2
.0,5- 2.p.q e
2
Keterangan : : 0,05
z : 0,5- 2 = 1,96 e : tingkat ketepatan yang diinginkan 10
p : proporsi = 0,5 q = 1-0,5= 0,5
n ≥ 1,96
2
.0,5.0,5 10100
2
n ≥ 96,04
Kesimpulan : Sampel minimal yang masih cukup representatif yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah sebesar 96 sampel Arman, 2006.
Kebutuhan 100 sampel dalam penelitian ini dilakukan dengan ke atas dari 96 sampel minimal yang masih representatif yang dibutuhkan. Populasi nyamuk
A.aegypti betina yang berasal dari 100 rumah-rumah penduduk yang sedang dan atau pernah menderita DBD yang dilakukan pada bulan September sampai dengan
November 2008. Nyamuk ditangkap dari habitat istirahatnya resting places di
33
dalam rumah, terutama di tempat-tempat yang lembab, gelap dan pakaian yang tergantung serta di bawah kolong menggunakan aspirator oleh 4 empat kolektor
pada pagi hari pukul 09.00 wib- pukul 11.00 wib dan sore hari pukul 16.00 wib– pukul 18.00 wib. Dari seluruh nyamuk yang terkumpul, diambil masing-masing 20
ekor nyamuk A.aegypti betina dari masing-masing Kecamatan dengan total sampel 100 ekor nyamuk A.aegypti betina. Nyamuk hasil tangkapan dibawa ke laboratorium
dan dimatikan dengan cara dimasukkan ke dalam kulkas dalam vial secara individual. Setelah mati, sampel nyamuk disimpan dalam kulkas pada suhu -70°C. Sampel
dipergunakan sebagai bahan untuk pemeriksaan virus. Virus yang akan diperiksa adalah virus Dengue serotipe DEN-4. Sampel nyamuk A.aegypti betina diekstraksi
untuk memperoleh DNA komplemennya, lalu dilakukan RT-PCR dengan menggunakan primer DEN-4 untuk mengamplifikasi DNA virus Dengue. Hasil
amplifikasi dielektroforesis dan difoto untuk melihat untaian pita DNA virus Dengue serotipe DEN-4.
34
III.4. Kerangka Kerja
Nyamuk A.aegypti betina dikumpulkan
Ekstraksi RNA virus Dengue
RT-PCR menggunakan primer D4
Elektroforesis
Visualisasi dengan gel imaging Jadwal rencana pelaksanaan keseluruhan penelitian dapat dilihat pada lampiran 1.
III.5. Pelaksanaan Penelitian III.5.1. Alat dan bahan
Alat :
1. Tip 25 µL
2. Tip 200 µL
3. Pipet merek Bio Rad ukuran 0,5-10µl, 2-10µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-
1000µl 4.
Vortex 5.
Oven 50ºC 6.
Pinset steril
35
7. Homogeniser steril
8. Microcentrifuge
9. Microwave
10. Beaker glass
11. Penggerus
12. Ice bath
13. Collection tube 2ml
14. Parafil film merek American National Can.
15. Tabung eppendorf
16. Tabung erlenmeyer
17. Tabung kultur dengan C636 cell line
18. Tabung kultur 12 ml plastik screw cap
19. Api bunsen
20. Aspirator
21. Inkubator
22. Baki steril
23. Freezer -20ºC merek Panasonic
24. Freezerrefregerator -70
C merek Sanyo VIP Series 86 C MDF-U53V
25. Mesin elektroforesis merek Bio Rad Power Pac Basic
26. Tangki elektroforesis
27. Multi block heater merek Barnsead Lab-Line, model number 2053-IQ
28. Mesin centrifuge merek Sorvall Biofuge Primo R
36
29. Mesin PCR thermal cycler merek Bio Rad, Cycler
30. Mixer Tipe 37600
31. Centrifuge merek Sorvall Biofuge Primo R
32. Lampu ultraviolet
33. Polaroid
34. Mesin pencitraanimaging merek Bio Rad
35. Biosafety Cabinet kelas II merek ESCO Class II Type A2 Lab Culture
Bahan :
1. Medium pertumbuhan MEM dengan 5 FBS Foetal Bovinus Serum
2. QIAamp® Viral RNA Mini Kit dari qiagen QIAamp MinElute Columns,
buffer AL, buffer AW 1, buffer AW 2, RNA-se free water atau buffer AVE, qiagen protease, carrier RNA, protease resuspension buffer
3. MgSO4
4. Superscript III RT
5. Etanol 96-100
6. Buffer TAE 50 ml
7. DMEM Drainage Enrich Medium
8. Aquadest 100 Ml
9. Free water nucleus
10. Agarose 1 gram
11. Syber safe gel stainning
37
12. Blue juice
13. Gel imaging Bio Rad
III.5.2. Isolasi virus
Nyamuk akan dicairkan defrost pada suhu yang diinginkan untuk proses isolasi, setelah itu diletakkan dalam ice bath. Nyamuk dihancurkan dan diletakkan dalam
tabung eppendorf dengan 1,5 ml medium pertumbuhan MEM dengan 5 FBS. Suspensi nyamuk diputar dengan kecepatan 14000 rpm pada suhu 4°C dan
supernatannya akan siap digunakan untuk isolasi virus di dalam tabung kultur dengan C636 cell line. Seluruh proses pemeriksaan sampel nyamuk dilakukan
per individu dan dicatat berdasarkan lokasi dan waktu penangkapan.
III.5.3. Ekstraksi virus
Virus RNA diekstrak dari 200 µl aliquots yang berasal dari supernatant sel terinfeksi dengan menggunakan QIAamp® Viral RNA Mini Kit dari Qiagen
dengan mengikuti protokolnya. Untuk memeriksa sampel, diperlukan 140 µl homogenat dari setiap sampel. Untuk kontrol positif, digunakan kultur sel yang
mengandung DEN-4 dalam volume yang sama, dan untuk kontrol negatif digunakan kultur sel tanpa virus Dengue.
38
III.5.4. Persiapan bahan III.5.4.1. Mempersiapkan qiagen protease
Sebanyak ditambahkan ke dalam qiagen protease dengan di campurkan dan tidak menggunakan vortex. Hasil campuran dipisahkan ke dalam 5-6 tabung
eppendorf di mana masing-masing berukuran 250 µl untuk 10 reaksi, kemudian disimpan ke dalam kulkas pada suhu -20ºC.
III.5.4.2. Mempersiapkan buffer A
Sebanyak 310 µl buffer AVE ditambahkan ke dalam tabung berisi ’carrier RNA’ 310 µg. Kemudian pisahkan ke dalam 5 tabung eppendorf di mana
masing-masing tabung berisi 62 µl untuk 10 reaksi, dan disimpan pada suhu -20ºC.
III.5.4.3. Mempersiapkan buffer AW 1
Sebanyak 30 ml etanol 96-100 ditambahkan ke dalam buffer AW 1, lalu disimpan pada suhu ruangan.
III.5.4.4. Mempersiapkan buffer AW 2
Sebanyak 30 ml etanol 96-100 ditambahkan ke dalam buffer AW 2, lalu disimpan pada suhu ruangan.
39
III.5.5. Pelaksanaan ekstraksi virus
Campuran buffer AL 1100 µL ditambahkan ke dalam 31 µl carrier RNA yang sudah bercampur buffer AVE. Sediaan medium terdiri dari MEM+5 FBS, di
mana 1 ekor nyamuk mengandung 300 µl medium 285 µL MEM+15 µL FBS. Dengan menggunakan pinset steril, diambil 1 ekor nyamuk dan dimasukkan ke
dalam eppendorf, lalu ditambahkan 300 µl medium. Nyamuk digerus dengan alat homogeniser steril.
Setelah 10 sampel selesai digerus, sampel-sampel dimasukkan ke dalam centrifuge dan diputar dengan 14000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit.
Setelah itu diambil 200 µL dari supernatant dan dimasukkan ke dalam 25 µl Qiagen Protease di dalam microcentrifuge atau eppendorf yang berukuran 1,5
ml.Lalu ditambahkan dengan 200 µl buffer AL dan carrier RNA. Semuanya diinkubasi pada suhu 56ºC selama 15 menit, lalu di briefly centrifuge dengan
8000 rpm selama 1 menit. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam kolum dan ditutup, lalu kembali disentrifugasi dengan 8000 rpm selama 1 menit. Collection
tube yang mengandung filtrat dibuang dan kolum dimasukkan ke dalam collection tube baru.
Hasilnya dicuci dengan buffer AW 1 dengan cara menambahkan 500 µl buffer AW 1, kemudian disentrifugasi dengan 8000 rpm
selama 1 menit. Collection tube yang mengandung filtrat kembali dibuang dan kolum dimasukkan ke dalam collection tube yang baru. Lalu hasilnya dicuci
dengan menambahkan 500 µl buffer AW 2, disentrifugasi dengan 8000 rpm selama 1 menit. Collection tube yang mengandung filtrat kembali dibuang dan
40
kolum dimasukkan ke dalam collection tube yang baru. Hasilnya dicuci dengan etanol dengan cara menambahkan 500 µl etanol 96-100, lalu disentrifugasi
dengan 8000 rpm selama 1 menit. Collection tube yang mengandung filtrat kembali dibuang dan kolum dimasukkan ke dalam collection tube yang baru.
Hasilnya disentrifugasi dengan 14000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan dry spin.
Kolum dimasukkan ke dalam collection tube yang baru dengan tutup terbuka, lalu diinkubasi dengan 56ºC selama 3 menit. Kemudian collection tube dibuang,
dan kolum ditempatkan pada microcentrifuge 1,5 ml. Buffer AVE sebanyak 20- 150 µl ±50 µl atau RNA-se free water dimasukkan ke tengah-tengah membran,
lid ditutup dan diinkubasi selama 1 menit dalam suhu ruangan. Lalu disentrifugasi dengan 14000 rpm selama 1 menit. Dari hasil sentrifugasi, kolum
dibuang dan RNA yang telah diekstraksi disimpan dalam freezer dengan suhu - 70°C.
Mencampur medium virus dilakukan di dalam wadah dengan menggunakan api bunsen. Pertama-tama harus membagi DMEM Drainage Enrich Medium ke
dalam tabung kultur 12 ml plastik screw cap sebanyak 0,5 ml per tabung. Lalu FBS sebanyak 0,5 ml ditambahkan ke dalam DMEM dan disimpan di kulkas
pada suhu 4°C.
41
III.5.6. RT-PCR
Yang merupakan urutan program PCR adalah : 1.
cDNA-sintesis, dengan suhu 60°C selama 30 menit. 2.
Pemanasan awal hot start, dengan suhu 92°C selama 3 menit. 3.
Denaturasi denaturation, dengan suhu 92°C selama 30 detik. 4.
Pendinginan annealing, dengan suhu 53°C selama 30 detik. 5.
Perluasan extension, dengan suhu 72°C selama 1 menit. 6.
Perluasan akhir final extension, dengan suhu 72°C selama 5 menit. Langkah RT dilakukan pada 60°C selama 30 menit untuk menghasilkan cDNA,
kemudian amplifikasi dengan step PCR berikut : 92°C selama 3 menit untuk permulaan denaturasi, 92°C selama 30 detik untuk denaturasi, 53°C selama 30
detik untuk pendinginan dan 72°C selama 1 menit untuk perluasan. Siklus ini diulangi sebanyak 40 kali sebelum perluasan akhir 72°C selama 5 menit. Produk
PCR ini disimpan pada 4°C sebelum digunakan. Master mix dibuat dengan mencampurkan 25µl dari 2x reaksi mix bufer yang
terdiri dari 0,4 mM dari dNTP, 3.2 mM MgSO4, 1µl dari 10µM primer universal, 1µl dari 10µM primer D4, 2µl superscript III RT, 4µl MgSO4 dan
ditambahkan aquadest sampai 20µl. Master mix ini dicampurkan dengan pipeting dan spin down. Proses pemutaran dengan menggunakan pipet dilakukan jika
diperlukan. Produk RNA dipersiapkan dengan memanaskan tube pada 65°C selama 15 menit dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di
dalam lemari es selama mempersiapkan master mix. Lima mikroliter produk RNA
42
ditambahkan ke dalam master mix, kemudian brief centrifuge dengan kecepatan 8000 rpm.
III.5.7. Elektroforesis
Cetakan gel agarose disiapkan dengan jumlah sumuran sesuai kebutuhan. Agarose 1-2 dalam 1X TAE buffer dipanaskan dalam microwave, kemudian
ditambahkan 1:10000 syber safe-TM sebanyak 7 µl, dan dituang ke dalam cetakan yang telah disediakan. Setelah gel agarose mengeras, dimasukkan dalam tangki
elektroforesis yang berisi 1X TAE buffer. Sebanyak 5-10 µl hasil PCR yang telah dicampur blue juice 2X dimuat ke dalam sumuran. Sebanyak 10 µl marker
dimuat juga pada sumur nomor 1 atau sumur terakhir. Elektroforesis dijalankan 80-100 Volt DNA akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif.
Hentikan elektroforesis jika tanda biru mencapai seperempat bagian bawah jangan sampai tanda biru hilang karena kemungkinan hasil PCR ikut terlepas
dari gel. Lihat gel agarose di atas lampu ultraviolet. Dokumentasi hasil PCR dengan polaroid atau kamera digital.
III.5.8. Imaging
Gel dimasukkan ke dalam alat foto. Sebelumnya tutupnya dibuka, kemudian tombol epi-white ditekan sampai muncuk di layar komputer. Setelah muncul di
layar komputer, tombol epi-white dimatikan. Tombol auto focus ditekan,
43
kemudian tombol UV ditekan sampai muncul band pada gel. Lalu freeze, analyze, kemudian transform. Hasil file dibuka, dicrop, disimpan dan dicetak.
44
45
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
