UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
cakram kloramfenikol 30 μg oxoid, cakram klindamisin 2 μg oxoid,
kertas cakram blank 6 mm oxoid, NaCl Merck, aquadest, larutan standar Mc.Farland 3 Remel, larutan kristal violet, larutan lugol 2, alkohol 96,
dan safranin.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian aktivitas antibakteri ini disterilkan terlebih dahulu. Cawan petri, dan tabung reaksi yang telah
disumbat dengan kapas disterilkan dalam oven pada suhu 170
o
C selama ± 2 jam, jarum ose dan pinset dibakar dengan pembakaran diatas api
langsung dan media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Lay dan Hastowo, 1992.
3.3.2 Pembuatan Media
A. Media Agar Miring
Nutrient agar sebanyak 5 gram dilarutkan dalam 250 mL aquades 20 g1000 mL menggunakan erlenmeyer. Setelah itu
dihomogenkan dengan stirer diatas penangas air sampai mendidih. Sebanyak 5 mL dituangkan masing-masing pada 5 tabung reaksi steril
dan ditutup dengan aluminium foil. Media tersebut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit, kemudian dibiarkan pada
suhu ruangan selama ± 30 menit sampai media memadat pada kemiringan 30°. Media Agar miring digunakan untuk inokulasi bakteri
Lay, 1994.
B. Media Pembenihan Nutrient Agar
Media pembenihan dibuat dengan cara ditimbang 5 gram NA, lalu dilarutkan dalam 250 mL aquades 20 g1000 mL menggunakan
erlenmeyer. Setelah itu, masing-masing media dihomogenkan dengan stirer diatas penangas air sampai mendidih. Media yang sudah
homogen ini disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit, kemudian didinginkan sampai suhu ± 45-50
o
C Lay, 1994.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.3 Peremajaan Bakteri Uji
Bakteri uji diambil dengan jarum ose steril sebanyak satu ose, lalu ditanamkan pada media agar miring dengan cara menggores secara zig-zag.
Inkubasi dalam inkubator pada suhu 37° selama 24 jam. Perlakuan yang sama dilakukan pada setiap jenis bakteri uji Siregar, 2009.
3.3.4 Identifikasi Bakteri
Identifikasi dilakukan berdasarkan pengamatan morfologi koloni meliputi pengamatan terhadap bentuk dan warna koloni Pelczar, 1986.
Identifikasi bakteri dilakukan dengan cara pewarnaan Gram. Pewarnaan
Gram mengutip dari Fitri 2011, akuades diteteskan pada kaca objek ditambahkan 1 ose biakan sampel, lalu difiksasi di atas api. Tetesi
pewarnaan kristal violet dan biarkan selama 1 menit, cuci dengan air mengalir, kemudian tetesi lugol 2 biarkan selama satu menit dan kembali
dicuci dengan air mengalir. Tetesi alkohol 96 biarkan selama 10-20 detik, cuci dengan air mengalir dan tambahkan safranin biarkan selama
20-30 detik kemudian cuci lagi dengan air mengalir. Keringkan dengan menggunakan kertas serap dan tambahkan minyak emersi dan amati di
bawah mikroskop. Bila hasil pewarnaan diperoleh bakteri berwarna merah maka bakteri tersebut adalah bakteri Gram negatif, sedangkan bila diperoleh
bakteri berwarna ungu maka bakteri tersebut adalah Gram positif.
3.3.5 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri uji yang telah diinokulasi diambil dengan kawat ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi 2 mL larutan NaCl 0,9
hingga di peroleh kekeruhan yang sama dengan standar kekeruhan larutan Mc. Farland Mpila D. A, 2012. Perlakuan yang sama dilakukan pada
setiap jenis bakteri uji dan jenis Mc. Farland yang digunakan adalah standar Mc. Farland 3. Kemudian diencerkan hingga memperoleh suspensi 10
7
cfumL dengan cara mengambil 1 mL suspensi kedalam tabung reaksi steril dan menambahkan 10 mL NaCl 0,9 steril. Jumlah bakteri yang sesuai
dengan standar Mc Farland 3 setara dengan ±9x10
8
mL Roslizawaty, 2013. Jumlah bakteri dalam suspensi harus berisi antara 10
7
dan 10
8
mL Andrews, 2001.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.6 Pembuatan Larutan Uji
